中药天年饮对衰老大鼠睾丸生精细胞凋亡及相关因素的影响

1、中药天年饮对衰老大鼠睾丸生精细胞凋亡及相关因素的影响【关键词】天年饮；,衰老；,生精细胞；,凋亡；,睾酮；,p53基因摘要：目的研究中药天年饮对衰老大鼠睾丸生精细胞凋亡及相关因素的影响。方法40只SD大鼠随机分为4组，正常组、衰老模型组、天年饮用药组及阴性对照组，每组均为10只。D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老的大鼠模型。采用ELISA方法检测各组大鼠血清睾酮含量、SP免疫组化法检测睾丸生精细胞p53蛋白的表达情况、TUNEL法检测各组大鼠睾丸生精细胞的凋亡情况。结果衰老大鼠血清睾酮含量明显降低模型组与正常组比拟：P0.05，衰老大鼠睾丸p53阳性细胞率及凋亡指数明显高于正常大鼠P0.01

2、。天年饮用药组大鼠血清睾酮含量较衰老大鼠明显升高P0.05，天年饮用药组大鼠睾丸p53阳性细胞率及凋亡指数较衰老大鼠明显降低P0.05，P0.01。结论中药天年饮可改善衰老大鼠的生精功能，具有一定延缓衰老的作用。关键词：天年饮；衰老；生精细胞；凋亡；睾酮；p53基因Abstrat：bjetiveTbservetheeffetsftraditinalhineseediineTiannianyinnapptsisandrelatedfatrsfsperatgeniellsintestisfagingrats.ethds40SDratsereappliedinthisstudyanddividedi

3、nt4grupsatrand:nralgrup,agingdelgrup,Tiannianyingrup,negativentrlgrup,andeahgruphad10rats.Thesub-autelyagingdelratsereadebyinjetingD-galintabdinalavityntinuusly.ELISAasusedtdetettheteststernententinseru,SPiunhistheistrytbservethep53expressinandTUNELtdetetapptsisfsperatgeniellsintestis.ResultsThetest

4、sternententinserufagingratsdereasedsignifiantlyparedithnralrats(P0.05);thep53psitiveellsandappttiindexfagingratsereuhhigherthanthseinnralrats(P0.01).Tiannianyinuldinhibitthedereasefteststernententinserusignifiantly(Tiannianyingrupparedithagingdelgrup:P0.05),anddereasethep53expressinandappttiindexsig

5、nifiantly(P0.05,P0.01).nlusinTraditinalhineseediineTiannianyinaniprvethesperatgenifuntinfagingrats,andhasfairlyanti-agingeffets.Keyrds：Tiannianyin;Aging;Speratgeniell;Apptsis;Teststerne;p53gene抗衰老是一个古老的话题，目前国内、外应用的抗衰老方法有很多。中药延缓衰老作用的研究已逐渐深化，在细胞传代、寿命实验、免疫内分泌代谢等领域进展了多方面的研究，提醒了不少药物的抗衰老机理，但各自研究的方面不同。天年饮由

6、刘河间?宣明论方?何首乌丸加味而成，由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝等组成，具有补肝肾、益精血、延年益寿之成效。本研究采用D-半乳糖致亚急性衰老的大鼠模型，观察天年饮对睾丸生精细胞凋亡及相关因素的影响，讨论天年饮延缓衰老的作用机制。1材料与方法1.1动物的选择及分组成年雄性SD大鼠40只，体重180250g由河北医科大学实验动物中心提供，合格证书：医动字第04057号。将大鼠随机分为4组，正常组、衰老模型组、天年饮用药组和阴性对照组，每组10只。其中模型组、用药组、阴性对照组均采用D-半乳糖连续腹腔注射按200gkg1-d-1给药，1次/d，连续40d制作亚急性衰老大鼠模型。模型组大鼠造模成功后不再做

7、任何处理；用药组大鼠造模成功后每天用天年饮灌胃，共30d；阴性对照组大鼠在造模成功后灌胃同等剂量的生理盐水，时间同用药组大鼠。1.2药品与试剂D-半乳糖(D-gal)由北京化学试剂公司消费(批号020402)。天年饮由炙何首乌、怀牛膝、肉从蓉、淫羊藿、丹参、茯苓等六味中药组成，经熬制后每毫升含生药1.5g灌胃。检测血清睾酮含量的ELISA试剂盒及免疫组化、凋亡试剂盒均购自北京中山生物技术。1.3指标检测1.3.1血清睾酮含量的检测大鼠经内眦取血，离心取上清，采用ELISA方法检测睾酮含量。1.3.2p53表达的检测及定量数据处理大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取双侧睾丸，后固定

8、过夜，常规石蜡包埋、切片，片厚5，按试剂盒说明以SP免疫组化法检测p53的表达情况，一抗为鼠抗p531100，阴性对照用PBS代替一抗。以细胞核出现棕黄色粗颗粒或细腻颗粒弥漫分布为阳性反响。p53阳性反响的切片在显微镜(400倍)下进展细胞计数，在切片上随机选取阳性细胞分布均匀的区域，每个切片检查10个视野，每个视野数出总细胞数和阳性细胞数，计算出阳性细胞的百分比。每组计数3只动物的睾丸，每个标本计数3张切片。1.3.3凋亡细胞的检测采用脱氧核苷酸末端转移酶TdT介导的原位末端标记法terinaldexynuletidyltransferaseediateddUTPnikedlabeling，

9、TUNEL检测凋亡细胞。以细胞内出现棕黄色粗颗粒或细腻颗粒弥漫分布为阳性反响。凋亡阳性细胞按Yin1的方法进展数据处理：显微镜下任选10个视野，计数生精小管横切面的总数及含凋亡细胞的阳性生精小管数；再计数10个生精小管中的总细胞数和阳性细胞数，计算阳性细胞的百分比。每组计数3只动物的睾丸，每个标本计数3张切片。1.4统计方法实验数据以s表示，应用SPSS11.5统计分析软件进展统计处理，以t检验和2检验进展分析。2结果2.1血清睾酮的含量结果见表1。表1各组大鼠血清睾酮含量和p53阳性细胞率比拟略与正常组比拟，*P0.05；与正常组比拟，#P0.01；与模型组比拟，*P0.05由表1可见，与正

10、常组相比，D-半乳糖诱导的亚急性衰老大鼠血清睾酮含量明显降低(P0.05)，天年饮可明显抑制衰老大鼠血清睾酮含量的下降，用药组与模型组比拟差异显著(P0.05)。转贴于论文联盟.ll.2.2TUNEL染色结果各组大鼠睾丸生精细胞均有凋亡发生，凋亡细胞包括精原细胞和初级精母细胞，阳性细胞核为棕黄色。正常大鼠凋亡细胞单个散在，而模型大鼠凋亡细胞成簇分布图12。各组大鼠睾丸凋亡管数和凋亡阳性细胞率见表2。表2各组大鼠睾丸凋亡管数和凋亡阳性细胞率比拟略与正常组比拟，*P0.01；与模型组比拟，*P0.01由表2可见模型组大鼠凋亡生精细胞数量较多，凋亡管数和凋亡阳性细胞率均明显高于正常组P0.01；用药

11、组大鼠生精细胞凋亡数量较少，凋亡管数和凋亡阳性细胞率与模型组比拟有显著差异P0.01,用药组大鼠睾丸生精细胞的凋亡指数明显低于模型组大鼠。图1正常大鼠凋亡生精细胞略图2衰老大鼠凋亡生精细胞略2.3睾丸生精细胞p53表达的变化p53蛋白阳性细胞主要为精原细胞，偶见支持细胞着色，阳性产物主要位于细胞核，呈棕黄色圆形分布，而阴性对照那么未见任何细胞着色图34。各组p53阳性细胞率见表1。由表1可见，模型大鼠p53阳性细胞率与正常大鼠相比明显升高P0.01；用药组大鼠p53阳性细胞率与模型组大鼠相比明显降低P0.05。3讨论近年来已有大量文献报道性腺功能衰退与机体衰老亲密相关1，2。随着年龄增长，睾丸

12、的构造和功能会出现一个由盛到衰的演变过程，出现精子生成才能减弱、血游离睾酮含量下降等变化。早在1889年法国医学家BrnSequard就认为睾丸提取液有“延缓衰老的奇效，并且目前性激素替代疗法仍是治疗许多老年病的主要方法，有研究发现补充睾酮可改善心肌缺血、抑制动脉粥样硬化3，4。图3正常大鼠p53的表达略图4衰老大鼠p53的表达略祖国医学认为精气虚弱是导致机体衰老的主要原因，?素问金匮真言论?有记载：“夫精者，身之本也，并认为“天癸竭，精少，肾藏衰，形体皆极是衰老的主要原因。肾为先天之本，肾藏精，其精气是构成人体和促进人体生长发育的根本物质。所以历代医家多用补肾为主的方药来延年益寿。天年饮由刘

13、河间?宣明论方?何首乌丸加味而成。何首乌丸本由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝组成，能填精补髓、乌发延年。于此根底上加淫羊藿补肾壮阳以强筋骨，丹参活血化瘀以通心脉，茯苓健脾利湿以宁心神。诸药相配通调心脾肝肾四脏，而以肾为主。现代研究也说明，何首乌、淫羊藿、丹参、肉苁蓉等具有改善脂肪代谢、改善心脑血管功能、抗氧化等多方面的作用。p53是重要的肿瘤抑制基因，在正常细胞中野生型p53基因参与细胞周期的调控5，具有阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组的稳定及抑制肿瘤血管生成等多方面的功能。在睾丸正常生精过程中，p53也起着重要的调控作用，研究发现，在衰老大鼠的睾丸中p53的表达程度是升高的，这些都提示p53可

14、通过调节生精细胞凋亡的发生来调节生精过程68。研究结果也说明p53参与了生精细胞的凋亡。实验研究发现，天年饮可以进步模型大鼠血清睾酮含量；明显降低衰老大鼠睾丸p53阳性细胞率；降低生精细胞的凋亡指数。说明天年饮可以通过进步血清睾酮含量、降低衰老大鼠p53表达、降低生精细胞的凋亡指数等来改善衰老大鼠的生精功能，起到延缓衰老的作用。参考文献：1YinYZ,HakinsKL,Delf,etal.HeatstressausestestiulargerellapptsisinadultieJ.JAndrl,1997,18(2):159.2PnhlzerA,PlasE,ShatzlG,etal.Assia

15、tinfDHEA-SandestradilserulevelstsyptsfagingenJ.Agingale,2002,5(4):233.3武强，李小鹰.雄激素治疗冠心病及其机制J.中华老年心脑血管病杂志，2002，33：90.4Katherine,RihP,JnesH,etal.Ldsetransderalteststernetherapyiprvesanginathreshldinenithhrnistableangina,arandized,duble-blind,plaeb-ntrlledstudyJ.irulatin,2000,102:1906.5TakeuhiA,ishinaY,iyaishi,etal.HeterzygsityithrespettZfp148ausespletelssffetalgerellsduringuseebrygenesisJ.NatGenet,2022,33(2):172.6YinY,StahlB,Delf,etal.p53-ediatedgerellqualityntrlinsperatgenesisJ.DevBil,1998,204(1):165.7