医学微生物实验5th邓秋婵

1、第五次实验课内容1、细菌代谢产物检查，数码鉴定（示教）2、肠道杆菌在选择鉴别培养基的生长情况 （示教） EMB、SS平板、双糖铁培养基、半固体培养基3、肥达试验（结果示教）4、肉汤增菌结果血平板接种（操作，每组一份）5、病例二讨论1原理：染色镜检普通琼脂平板中菌落的形态不能鉴别能够鉴别实验一 细菌代谢产物检查，数码鉴定细菌代谢产物分解代谢产物合成代谢产物生化反应?2细菌菌落的色素观察金黄色葡萄球菌：产生只局限于菌落的脂溶性金黄色色素。铜绿假单胞菌：产生带荧光的水溶性色素，该色素可扩散至菌落周围，使培养基呈亮绿色。金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌3细菌菌落的溶血现象观察乙型溶血性链球菌:透明的无色溶血

2、环。SLO or SLS？4一、糖发酵试验原理：不同细菌分解糖类的能力和分解代谢产物不同应用：常用于肠道细菌的鉴定5结果判定 培养基变红色 阳性，记为 + 培养基变红色，试管内有气泡 阳性，记为 + 指示剂不变色 阴性，记为 - 葡萄糖乳糖伤寒沙门菌糖发酵试验大肠埃希菌糖发酵试验痢疾志贺菌糖发酵试验副伤寒沙门菌糖发酵试验糖发酵试验6IMViC是吲哚（indole）、甲基红（methyl red test）、V-P（Voges-Prokauer test）和枸橼酸盐利用（citrate test）四个试验的缩写，用于快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌（卫生细菌学检查）细菌代谢产物检查，数码鉴定7二、靛基

3、质（吲哚）产生试验(I)原理： 分解蛋白胨内的色氨酸形成靛基质（无色） 靛基质与靛基质试剂中的对二甲基氨基苯甲 醛结合而显红色(玫瑰吲哚)材料：蛋白胨水培养基（氯化钠、蛋白胨、 蒸馏水）8方法： 约0.3ml的靛基质试剂徐徐加入细菌蛋白胨水培养物 注：加入吲哚试剂后切勿摇晃结果：大肠埃希菌()红色 产气杆菌 ()黄色红色吲哚大肠杆菌产气杆菌9葡萄糖丙酮酸甲酸、乙酸、乳酸pH 5.4培养基呈橘黄色（-）脱羧大肠埃希菌和产气杆菌都能发酵葡萄糖，产酸产气产气杆菌能使丙酮酸脱羧大肠杆菌三、甲基红试验（M）10材料：葡萄糖蛋白胨水（葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、蒸馏水）方法：结果：大肠埃希菌，红色 产气

4、杆菌，黄色 11葡萄糖丙酮酸甲酸、乙酸、乳酸乙酰甲基甲醇红色化合物（+）脱羧四、VP试验（Vi）大肠埃希菌和产气杆菌都能发酵葡萄糖，产酸产气产气杆菌能使丙酮酸脱羧大肠杆菌在碱性溶液中被氧化VP试剂（李氏试剂）不能反应（-）反应30min二乙酰+精氨酸胍基12材料： 葡萄糖蛋白胨水 李氏试剂（硫酸铜、 浓氨水、NaOH、蒸馏水）方法：暴露于空气中结果:大肠埃希菌，不出现红色（） 产气杆菌， 红色 （）大肠杆菌产气杆菌13五、枸橼酸盐利用试验（C）枸橼酸盐铵盐碳酸盐氨培养基pH下降溴麝香草酚蓝 呈碱性变色培养基变蓝培养基产气杆菌能利用铵盐作为唯一氮源，利用枸橼酸盐作为唯一碳源14 材料： 枸橼酸盐

5、培养基（枸橼酸钠、NH4H2PO4、MgSO4、K2HPO4、NaCl、琼脂、蒸馏水、0.5%溴麝香草酚兰酒精溶液） 方法： 结果： 大肠埃希菌，绿色（） 产气杆菌，深蓝色（）产气杆菌大肠杆菌有无菌落？15用于肠杆菌科属间鉴别大肠杆菌产气杆菌 IMViC试验总结16 分 解六、硫化氢产生试验 原理： 材料： 醋酸铅培养基（普通琼脂培养基、硫代硫酸钠溶液、醋酸铅溶液）含硫氨基酸硫化氢遇铅盐或亚铁盐黑褐色沉淀17方法：结果： 变形杆菌，黑褐色 大肠埃希菌，不变色 变形杆菌大肠杆菌18对蛋白质的发酵吲哚试验硫化氢试验对糖的发酵糖发酵试验甲基红试验VP试验其他枸橼酸盐利用试验19实验原理 该试剂条是由

6、20个含干燥底物的小管所组成，用细菌悬浮液接种。培养一定时间后，通过代谢作用产生颜色的变化，或在培养后加入试剂后变色而观察结果。肠道杆菌数码鉴定（API 20E）20判读结果：每三项为一组，每组分值为1 2 4 分）将阳性反应的分值相加，得出数据编码，从API20E编码手册中查细菌名称。数码鉴定（API 20E）21（21）半固体培养基(动力试验) 大肠埃希菌 志贺菌 伤寒沙门菌 22材料：1、 EMB培养基、SS琼脂平板、双糖铁培养基2、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌选择培养基肠道杆菌在选择鉴别培养基的生长情况鉴别培养基23 伊红美蓝培养基（EMB）EMB平板基质 肉汤基础培养基抑制物 伊红

7、、美蓝底物 乳糖 指示剂 伊红、美蓝 碱性 无色半透明菌落 酸性紫黑色或紫红色，且有金属光泽菌落持点为紫黑色或紫红色菌落为无色半透明菌落抑制作用抑制G菌用途分离沙门菌和志贺菌属的弱选择培养基24原理：（EMB平板)非致病菌：致病菌：美蓝 分 解乳糖伊红结合紫黑色或紫红色化合物不分解乳糖，菌落呈无色、半透明。其它类似培养基？25SS培养基（Salmonella Shigella Agar Medium）SS平板基质肉汤基础培养基抑制物胆盐、煌绿、枸橼酸钠、硫代硫酸钠底物乳糖指示剂中性红 pH（6.88.0） 碱性黄色 酸性红色菌落持点为粉红色菌落为无色半透明菌落 抑制作用抑制大肠杆菌及G菌用途分

8、离沙门菌和志贺菌属的强选择培养基26原理：（ SS平板）非致病菌：致病菌：胆盐 分 解乳糖乳酸胆酸中心浑浊的粉红色菌落不分解乳糖，菌落呈透明无色；枸橼酸铁能指示硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色注意： 非致病菌并非被杀灭，故挑病原菌菌落时，尽量挑取菌落中心部分27大肠埃希菌痢疾志贺菌大肠埃希菌与伤寒沙门菌28双糖铁培养基（Double sugar Iron Medium）成分 含酚红指示剂的pH7.6的蛋白胨水 500mL 琼脂(1.3%) 6.5g 乳糖(1%) 5g 葡萄糖(0.1%) 0.5g 硫酸亚铁铵(0.02%) 0.1g 硫代硫酸钠(0.02%) 0.1g用途 初步鉴别肠道杆菌29原

9、理：只分解葡萄糖 ： 产少量酸 上层培养基的酸+O2CO2 +H2O 蛋白胨代谢产物 下层培养基不接触空气培养基呈酸性显黄色葡萄糖、乳糖都分解硫酸亚铁铵：用以检查细菌分解蛋白质后是否产生硫化氢。只产酸产酸&产气培养基略变碱指示剂变红30 肠道杆菌的生长结果 SS EMB 双糖铁大肠埃希菌 粉红色大菌落 紫黑色或紫红色 黄色痢疾志贺菌 无色细小 无色、半透明 上红下黄 半透明菌落伤寒沙门菌 无色细小 无色、半透明 上红下黄 半透明菌落 黑色沉淀31特异性抗体（血清中）诊断菌液肉眼可见的凝集现象检测试剂的成分病人体内的反应伤寒或副伤寒病人O抗原H抗原含有伤寒沙门菌O抗原伤寒沙门菌H抗原甲型副伤寒沙

10、门菌H抗原肖氏沙门菌H抗原肥达试验（Widal test）32方法：1、每孔加0.5ml N.S2、倍比稀释病人血清，第7孔不加做对照3、每孔加0.5ml抗原4、轻轻振荡混匀后，37孵育过夜33结果观察+ 清澈透明，菌体形成凝块于管底 + 较透明，大部分菌体形成凝块于管底 + 稍浑浊，较多细小凝集 + 较浑浊，有细小凝集 浑浊，无凝集血清凝集效价： (抗体滴度) 与定量Ag产生明显凝集（+）的血清最高稀释倍数34结果分析（1） 伤寒沙门菌“O” 效价1：80 “H” 效价1：160 副伤寒沙门菌“H”效价1：80O、H效价正常值，肠热症可能性大正常值，可能性小O高H不高：感染早期or交叉反应O

11、不高H高：预防接种、非特异性回忆反应有诊断价值35O抗原 沙门菌属间有交叉反应 IgMH抗原 种特异性 - 伤寒沙门菌 IgG 甲型副伤寒沙门菌 肖氏沙门菌 希氏沙门菌结果分析（2）36肉汤增菌结果血平板接种1、观察肉汤增菌的结果2、接种 视细菌的培养条件而用不同的平板血标本肉汤增菌血平板分离培养革兰染色血浆凝固酶+触酶试验病例137病例二 患者：男性，19岁。恶心、腹痛4h，伴水样腹泻3次入院就诊。无呕吐、寒颤。腹痛呈阵发性。既往体检无过敏史。 体检：T38.5，BP134/75 mmHg，P100次/分，R16次/分。心肺正常。上腹压痛，而无反跳痛。肝脾未触及。 实验室检查：粪便镜检可见中

12、性粒细胞，偶见红细胞。血象正常。尿正常。问题：1该患者可能患了什么疾病？需与哪些疾病作鉴别诊断？2如何进行微生物学检查？ 381、病例分析：感染中毒引起腹痛和腹泻的可能原因有哪些？肿瘤食物过敏炎症性肠病溃疡腹外疾病肠易激综合征39主诉：阵发性腹痛、腹泻肠道感染细菌病毒寄生虫真菌?肠杆菌科：大肠埃希菌、志贺菌属、沙门菌属弧菌科：霍乱菌、副溶血性弧菌弯曲菌属：空肠弯曲菌球菌科：金黄色葡萄球菌等轮状病毒、Norwork病毒和肠腺病毒等溶组织阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫等念珠菌、曲菌、毛霉菌等40初诊：细菌感染引起的急性胃肠炎何种细菌？主要的肠道细菌： 大肠杆菌 志贺菌 沙门菌 霍乱弧菌 副溶血性弧菌 幽门螺杆菌 空肠弯曲菌41区别要点侵袭性（炎症性）毒素性潜伏期长，110天不等短，几小时3天不等发热多而时间长少见呕吐少见多见腹痛明显，有压痛多数轻，个别有绞痛里急后重可有无脱水较少见较多见大便性状脓血便和粘液稀便，便中有大量白细胞稀水样便，无脓血和粘液病理改变肠道粘膜受损肠道粘膜完整毒素性：霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、大肠埃希菌某些菌株、腊样芽胞杆菌、变形杆菌、气单胞菌等炎症性：志贺菌、沙门菌