反相高效液相色谱法测定茶籽饼中茶皂素

1、反相高效液相色谱法测定茶籽饼中茶皂素摘 要 : 研究了用索氏提取器提取茶籽饼中茶皂素 , 反相高效液相色谱 法测定茶皂素含量的方法;以RP-ODS C18(150 mm*4.6 mm*5ym)作 分析柱，以甲醇作流动相，流速控制在0.50 mL*min-i,检测波长为280 nm,以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标,得到工作曲线，其回归方程 为 Y=3.54*106X+1.15*105, 相 关 系数为 0.999 7 。 测 得回收率在 97.2%102.1%之间,相对标准偏差(n=7)小于0.35%。我国有丰富的茶籽资源,茶籽经榨油后剩下的副产品茶籽饼一般 作为烤火用材料或虾等无鳃动物的饲

2、料。茶籽饼中含有 6%8%的茶 油及 10%14%的茶皂素,因此,深度开发茶籽饼、提高其附加值,实现 资源的可持续利用,具有很大的经济效益和社会效益。茶皂素是属于五环三萜类植物皂甙,是一种天然的非离子型绿色 表面活性剂,其用途非常广泛,在医药、建材、水产、农药、化妆品、 洗涤等各方面均有应用和研究报道。茶皂素的含量是衡量产品质量的 重要指标。常用的分析方法是重量法和比色法 ,但使用重量法分析所 需的时间长、操作繁琐及试剂消耗量大,难以满足工业上分析的需要; 比色法虽所耗试剂少、数据重现性强,但需用显色剂配成溶液,操作复 杂且准确度不很高。反相高效液相色谱法可分析茶皂素的含量 ,方法 简便易操作

3、,相关文献报道很少。本工作采索氏提取器提取茶籽饼中茶皂素 ,选择合适的最大吸收 波长,排除了黄酮和单宁酸的干扰 ,优化了色谱条件 ,建立了反相高效 液相色谱法测定茶籽饼中茶皂素含量的分析方法。通过对比试验 ,证 明了直接对提取液中茶皂素进行高效液相色谱法(HPLC)检测时无其 他物质的干扰,HPLC检测茶皂素方法的可行性。1 试验部分1.1 仪器与试剂756紫外分光光度计;LC-2010A液相色谱仪。甲醇为色谱纯，其它试剂 为分析纯,乙醇重结晶后质量分数为 98%。色谱条件RP-ODS C18液相色谱柱(150 mm*4.6 mm*5卩m),柱温为室温,流动相 为纯甲醇,流速为0.50 mL*

4、min-1,检测波长为280 nm,进样量为10yL。标准溶液的配制称取茶皂素标准品0.435 0 g,用甲醇超声溶解后置入50 mL容量瓶中, 并 用 甲 醇 定 容 , 配 成 8.7 g*L-1 茶 皂 素 标 准 溶 液 。 分 别 移 取 0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0 mL 于 50 mL 容量瓶中,并用甲醇定容,摇匀, 经0.45Lm微孔滤膜过滤，置于冰箱中68C保存备用。试验方法1.4.1 索氏提取样品称取经研磨的茶籽饼13.246 1 g,用滤纸包捆好，置于烘箱中，在温度70C时保持2 h,除去水分后放入索氏提取器中，用甲醇200 mL,回流提取4

5、 h,控制提取速度为回 流1次*5min-i。提取后，将甲醇提取液冷却，移入250 mL容量瓶中，用 甲醇定容。用移液管移取提取液4.0 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀 释至刻度，摇匀，经0.45Lm微孔滤膜过滤，备用。样品的测定按色谱条件对茶皂素标准溶液和茶籽饼样品溶液进行分析。茶皂素属 三萜类皂素，由配基、糖体和有机酸形成的结构复杂的化合物，在5 min 内出现两个峰，两峰的面积呈一定的比例关系，不同地区的茶籽饼样品 中两峰的面积比不同，在作标准工作曲线和计算未知样品溶液中茶皂 素含量时，以两峰的总面积进行计算（图 1）。2 结果与讨论2.1 最大吸收波长的选择用 756 紫外分光光度

6、计对茶皂素标准溶液进行扫描，见图2。从图2中可以看出，在200600 nm波长范围内,出现了 3个吸收峰, 分别在 215，280，350 nm 波长处。由于溶剂甲醇的最大吸收波长位于 210 nm 处，215 nm 波长处受溶剂甲醇的干扰很大，不能作为最大吸收 波长;350 nm波长处出现的吸收峰比较宽，检测灵敏度不高。280 nm处 出现的吸收峰峰形尖锐，灵敏度高，此处受溶剂甲醇的干扰很小 ，选择 最大吸收波长为 280 nm。样品处理方法的优化样品研磨过孔径 0.074 mm（200 目）筛后用甲醇浸提茶皂素两次，每次24 h,浸提液与固体用过滤或抽滤的方法分离,该法效率低、需要时间长。

7、采用沙滤分离,则第 二次浸提不很彻底,所需时间也较长。采用索氏提取器直接提取茶皂 素，需要4h,不需要过滤,处理更为简便、快速、准确。因此，采用索氏 提取器提取茶籽饼中茶皂素,适当稀释后直接进行 HPLC 测定。流动相和流速的选择用不同比例的甲醇和水的混合溶液作流动相进行试验。经试验 ,以 纯甲醇作流动相时能达到最佳分离效果 ,所以用甲醇作配制茶皂素溶 液的溶剂和 HPLC 试验的流动相。同一标准溶液依次用流速为 1.0,0.95,0.9,0.85,0.80,0.75,0.70,0.65,0.6,0.55,0.50,0.45,0.40 mL*min-1 的 甲醇进行试验,结果表明:在 0.50

8、 mL*min-1 的流速下,茶皂素的保留时 间不长,两峰分离效果好,柱效高,柱压较低,安全性高。试验选择流动相 甲醇的流速为 0.50 mL*min-1。标准曲线的制作和线性试验 按色谱条件对标准系列溶液进样分析,分别以标准系列溶液的总峰面 积为纵坐标,标准系列溶液的质量浓度为横坐标,绘成标准曲线。其线 性回归方程Y=3.54*106X+1.15*105,相关系数为0.999 7,线性范围为 0.0361.271 g*L-1。回收试验称取茶籽饼样品,加入适量茶皂素标准品,按试验方法进行样品索氏提 取,进行回收试验,测得茶籽饼样品中茶皂素量为 3.48 mg。样品分析茶籽饼样品经索氏提取后,甲

9、醇提取液经减压蒸馏回收甲醇,得到黄 色固体物质。将固体物质配成 pH 4 的 50 g#L-1 水溶液,备用。将已预处理好的大孔吸附 AB-8 树脂用自然沉降法装入离子交换柱 中,反洗,甲醇淋洗,再用去离子水淋洗柱子。茶籽饼样品溶液以 0.50 mL*min-i上样后，在分液漏斗中加入1 g*L-1氢氧化钠溶液，清洗至流出 液无色,再用水洗至中性,最后用 80%甲醇进行淋洗,控制流速为每小 时 2 个床体积。收集甲醇淋洗液，蒸馏、浓缩、烘干，得浅黄色固体物 质。取一定量浅黄色固体物质配成甲醇溶液，过0.45pm微孔滤膜后按 色谱条件进行分析。茶籽饼样品经索氏提取后直接进行分析的色谱图见图 3;茶籽饼样 品经索氏提取后再经大孔树脂纯化后的色谱图见图4。从图 3 和图 4 可以看出:色谱峰峰形好，分离度高，出峰时间在 5 min 内，分离分析时间短。于 280 nm 波长处测定提取液，在保留时间 9 min 处，有很少的杂质峰（图 3），对测定茶皂素的干扰很小。经大孔树脂纯化后 ， 茶皂素纯度很高，没有杂质峰出现（图 4）。依据线性回归方程可计算出