荧光定量原理与应用(第三版)课件

1、实时荧光定量PCR技术与应用定量PCR定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析IQ5 Real-time PCR仪PCR反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA多聚酶引物模板DNA或缓冲液荧光物质荧光曲线 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图定量原理 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念： 荧光阈值、Ct值Ct值的概念定量原理Ct值的定义是PCR

2、扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数C(t) 值C(t) 值18.12 +/0.04-阈值线Log浓度与循环数呈线性关系初始 模板量越多, 扩增产物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少确定初始模板的浓度定量原理108Real time PCR 106108Real time PCR 104108106Real time PCR 108106102104T11.124.631.917.7Real time PCR Real time PCR 105 copies/wellReal time PCR 定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct

3、值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。 如何定量荧光强度-循环数曲线初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线.未知10410310610510210首先确定未知样品的 C(t)值 借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量unknown104103Unknown contains 3108 copies如何定量为什么要用Ct值定量实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。 Ct值的重现性100 fold dilution series中点法分析（半定量）的局限10810610210496 Identic

4、al replicates提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量方法 定量PCR技术延伸 基因分型（SNP）检测 熔解曲线分析实时荧光定量PCR技术简介： SYBR Green 1 Molecular Beacons TaqMan荧光化学SYBR Green I 工作原理 SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 1染料结合状态时荧光强度是非结合状态的800-1000倍GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBR Green ISYBR Green ISYBR Green I

5、SYBR Green IMelt Curve AnalysisMelt Curve AnalysisMelt Curve AnalysisSYBR Green I 优点 使用方便 - 不必设计复杂的荧光探针 没有序列特异性 - 可以用于不同的模板 便宜 灵敏SYBR Green I 缺点 与非特异性产物结合提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量方法 定量PCR技术延伸 基因分型（SNP）检测 熔解曲线分析实时荧光定量PCR技术简介：多重PCR在一个PCR管中进行多个不同的PCR反应： 同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因 目标基因 内参照基

6、因（看家基因）不同荧光标记的探针识别不同的靶基因多重PCR的好处：减少初始模板用量减少试剂消耗、增加实验通量内参照基因 解决模板提取过程中造成的差别 解决样品材料不均一造成的差别 解决加样过程中的差别内参照基因多通道技术多通道技术：使用多种荧光染料在不同的检测通道内同时测定多种不同荧光染料发出的荧光1、引物及探针问题-引物及探针的相互干扰2、不同PCR反应要在同样扩增条件下进行2、模板量差别-共用资源的相互竞争多重PCR技术问题一个PCR管内进行多重PCR扩增要解决的问题：提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量方法 定量PCR技术延伸 基因分型

7、（SNP）检测 熔解曲线分析实时荧光定量PCR技术简介： 绝对定量 确定初始模板的准确含量 需要标准曲线 相对定量 确定样品间初始模板的含量倍数差异 相对标准曲线 不使用标准曲线，利用Ct值计算 Ct方法 Ct方法（看家基因） Pfaffl方法（考虑扩增效率） Vandesompele方法（多看家基因）14500 copies定量方法 利用相对标准曲线定量，定量结果相除得到倍数差别 同时建立两条标准曲线 一条目的基因的标准曲线 至少再做一条看家基因的标准曲线 借助标准曲线校准扩增效率的影响 使用标准曲线法进行相对定量分析相对定量标准曲线法 表达差异基因表达差异分析（替代Northern Blo

8、t)：responses to a particular stimulustissue differentiationstages of developmentcell proliferationdisease state progression研究方面部分应用材料和方法50C,30min95C,15min94C,15sec60C,1minplate readgo to step 3,39 more times10C,foreverEnd提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量方法 定量PCR技术延伸 熔解曲线分析 基因分型（SNP）检测实时荧光

9、定量PCR技术简介：Temperature increasesFluorescencedecreasesTm Graph fluorescence intensity vs. temperature Decreasing fluorescence recorded - Due to increasing temperature - Due to denaturation and release of SGI Tm is the point of inflection on the melting curveSYBR Green I 融解曲线分析荧光强度的倒数取负数后对温度作图(-dI/dT)-

10、dIdTTmSYBR Green I 融解曲线分析溶解曲线的作用 溶解曲线分析的主要作用 预实验中用于判定产物的纯度 是否存在引物二聚体和非特异性产物 预实验中结合温度梯度功能用于 判定最佳退火温度 基因分型或SNP产物特异性分析10,000 copies非特异性产物目的产物目的产物10 copies10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲线扩增曲线1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. Plate Read6. 84oC for 1 sec7. Plate

11、 Read8. Go to line 2 39 more times9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.产物特异性分析10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲线1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. Plate Read6. 84oC for 1 sec7. Plate Read8. Go to line 2 39 more times9. Melting curv

12、e from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.扩增曲线产物特异性分析 进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计 用于优化扩增产物产量和特异性的参数 引物设计 扩增片段选择 试剂的浓度 循环条件 变性温度和退火温度PCR体系优化利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化退火温度的优化45oC55oC65oC溶解曲线扩增曲线1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec

13、6. Plate Read7. Go to line 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, hold 1 sec.退火温度的优化提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量方法 定量PCR技术延伸 熔解曲线分析 基因分型（SNP）检测实时荧光定量PCR技术简介：实时荧光定量PCR应用定量： DNA定量 RNA定量定性： SNP分析 基因型分析 RNA变异分析 融解曲线分析 定量PCR应用I-实时定量 病原体定量检测 转基因拷贝数的检测DNA定量拷贝数研究（替代Southern Blot）RNA定量基因表达差异（替代No