精密度的评价第三大组第二小组good

1、3/3实验设计EIS检测AF试验精密度的评价原理：免疫学原理:采用双抗体夹心一步法,用纯化的甲胎蛋白（FP)抗体包被微孔板,制成固相抗体,同时向微孔中加入FP与辣根过氧化物酶（HR）标记的AP抗体，经过一次温育,然后彻底洗涤，加入底物TMB并避光显色,TB底物经P催化反应为蓝色物质,使溶液呈现蓝色,加入强酸（H2SO4）终止剂后，溶液呈黄色,其颜色(黄色）的深浅与AF浓度呈正相关。精密度是指在相同条件下，对同一被测物多次测量,每次测量结果之间的接近程度.精密度评价原理：用酶标仪在主波长为45nm,次波长为630nm下，1in内测定各孔吸光度。ELISA的精密度可用其反义概念不精密度体现，不精密

2、度可用标准差（S）和变异系数(V）反映：平均值 QUO MERGEFORMT 标准差QUOTE MRGFRAT 变异系数CV= QTE MRGFORAT仪器和试剂：试剂：高浓度的(40g/ml）AFP血清1。5l，低浓度(20g/m）A血清1.5m，蒸馏水，（AF）ELISA试剂盒(酶联板、H标记的抗A抗体、A阴性对照试剂、FP阳性对照试剂、显色剂A、显色剂B、终止液、封板膜）.仪器：酶标仪、微量加样枪(50）及配套吸头、恒温水浴箱、洗板机、吸水纸、消毒缸、洗瓶、记号笔、洗耳球.试验方法:用前0分钟从冰箱中取出试剂和待测标本，恢复至室温。将恒温箱或恒温水浴箱调至反应温度37按序编号:阳性对照孔

3、：1、2，阴性对照孔:3、5和空白孔,高浓 度血清加样孔为：7-2,稀释血清稀释液加样孔为：2746。4、 加样：向阳性对照孔、阴性对照孔分别加入阳性对照试剂、阴性对照试剂各50ul,空白孔不加任何试剂，向7-26号孔中各加入高浓度血清50l、向276号孔中加入低浓度血清液各50ul，并向每孔中加入酶标AF抗体0u,空白孔不加，轻轻震荡混匀。5、温育：用封板膜进行封板,将微孔板置于37恒温水箱温育30min。、洗涤：取出微孔板,用洗板机浸泡次，每次20s,最后一次结束后在吸水纸上尽量拍干。7、显色:每孔中依次加入显色剂、显色剂B 各50ul，室温避光显色5n。8、比色测定：每孔中加入终止液0u

4、l，轻轻震荡混匀,在阴性对照孔为无色，阳性对照孔为黄色,空白孔为无色的情况下,设定酶标仪主波长为450nm、次波长为63nm对每孔进行吸光度A的测定，并进行记录。吸光度值123456789101111611922122324252622290312334356373839041424344446结果判断:有效性判断:阳性对照孔A值0，阴性对照孔A值0.1，否则实验实效。阴阳性对照孔可用，则阳性为黄色，空白对照孔、阴性为无色，样品孔呈黄色。此时可利用各样品孔A值对IS进行精密度的评价。3、标准差越小，精密度越好；变异系数越小，精密度越好，且变异系数小于5 。实验结果计算和统计学处理:分别计算出平

5、均值、标准差和变异系数并进行精密度的评价。平均值 QOTE RGFORMA 标准差 UOTE *ERGEFRMAT 变异系数CV= QUOTE EEFORAT 分别计算出平均值、标准差和变异系数并进行精密度的评价。质量控制： 、实验必须设置阴阳性对照和空白对照从而保证实验的可信性和质量。2、试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡1530分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存.3、样品：样品应用已知的浓度的样品，避免AFP浓度过高而超出IS最高检测限、血清稀释时要足够稀释。 4、加样：要使用正确的加样技术，使加样枪的洗头稍高于微孔的平面,不能触及微板和微孔中的液体，而且不能

6、将液体溅出微孔外、加样枪必须是校准过的，并且所有加样时间最好控制在min之内。 5、温育:温育时要进行膜封,封板膜应限制一次性使用；温育时应将微孔板置于湿盒内,进行温育。温育时间不能过短,避免特异性结合不够，测得值偏低，时间也不能过长，非特异性结合物紧附于微孔上，难以洗干净,使测得值偏高。 6、洗板:微孔板的清洗是实验的关键,应进行彻底的洗净，并拍干，但不能完全干燥。并且每个微孔的洗涤液不能溢出到另外的微孔。 7、显色：显色剂必须保证没有过期,在加显色剂时要准确，避免溅出孔外，要用一次性吸头,加显色剂时间要越快越好,从第一孔到最后一孔不能超过10mn。 8、终止:在加终止液是不能产生气泡,剂量

7、要准确。 、数据处理时，应去掉离散值，然后进行计算。这是注意事项和影响因素吧？这是注意事项和影响因素吧？1、所用ELISA试剂必须为同一厂家、同一批次,不同厂家和不同批次的试剂不能混合使用.EISA试剂盒试剂没有变质.阴阳性对照试剂和酶标抗体可用。加样时不能将样品混合，每个微孔的样品试剂不能溅出到其他微孔。加样品时，每个孔的剂量必须一致,避免测量结果的大幅度波动.每加一个微孔应换一次吸头，避免交叉污染和剂量的不一致。显色剂的量必须准确，并且次序为先加显色剂A,再加显色剂B。洗涤时,必须是彻底洗净,特别是加入酶标抗体后的洗涤，那是本实验的关键步骤。在最后结果判断和A的测定时,前提条件是阴阳性对照可用的情况，如果阴阳性不可用,及阴阳性对照无效,则本实验无效，不能用于ELISA精密度的评价.应另外选用LISA试剂盒。、显色时应避光显