粒径和表面电荷测定

1、聚乙烯亚胺-DNA复合物粒径和表面电荷的测定实验导读在聚乙烯亚胺作为基因药物载体的研究中，PEI-DNA复合物的粒径在生物相容性和细 胞转染中起着重要作用。带电荷的结合物随孵育时间的延长，会发生复合物的聚集和沉淀， 同时复合物的表面电荷大小和介质的离子强度也直接影响着聚集程度。通常认为PEI-DNA 结合物在低N/P比时所形成的聚集，主要是因为结合物间范德华力的作用，相反高N/P比 时，聚集程度降低，是因为结合物表面较高电荷所产生的静电作用，发生静电排斥，使其在 生理条件下比较稳定。介质的离子强度与聚集程度密切相关。在所用的介质中，有低离子强 度的双蒸水，5%葡萄糖溶液，中高离子强度的生理盐水

2、、磷酸缓冲溶液等。在10mmol/l的 氯化钠溶液中，60分钟后结合物的粒径可达500nm，在150mmol/l的氯化钠溶液中，放置 30分钟后，其粒径可能大于900nm，而在0.5XPBS缓冲溶液中，PEI-DNA结合物具有稳 定的粒子大小，可在3小时内保持在120-400nm左右。下图是用透射电镜测定复合物的粒 径。图1聚乙烯亚胺-DNA复合物的透射电镜照片一、实验目的了解聚阳离子载体与质粒DNA复合物的结合过程，掌握纳米复合物的制备。掌握纳米复合物粒径和表面电荷的测定方法。二、实验原理非病毒性纳米转基因载体与质粒DNA复合物的粒径大小直接关系和影响着体外细胞和 体内动物的基因转染效率。因

3、此，对载体/DNA粒径尺寸的控制在研究中有着重要的意义， 同时也需要用准确的实验方法测定和监控实验过程中纳米载体/DNA复合物纳米微粒的形 成、聚集过程，纳米微粒的外观形态等，为基因转染效率的提高提供科学的依据。测定纳米 粒子粒径的方法较多，而纳米动态光散射式粒径分布仪是较为常用和方便的测定方法。纳米动态光散射式粒径分布仪在纳米微粒测定时，采用动态光散色原理。在光学测量系 统中，光源为650纳米半导体镭射光，检测器为光电倍增管，能测定的纳米微粒粒径范围是 1-6000纳米。下图是LB-550型纳米动态光散射式粒径分布仪。图2 LB-550型纳米动态光散射式粒径分布仪三、仪器与试剂1 仪器：90

4、Plus/BI-MAS （Brookhaven Instruments Corporation）粒径仪。2试剂：聚乙烯亚胺，质粒DNA pCAG。四、实验步骤（注：以下均为无菌操作）1）聚乙烯亚胺载体材料溶液的配制称取PEI25 kDa 90 mg，将其溶于20 ml水中得到母液，其含N浓度为100nmol/pL。取30 pl 该母液稀释至0.5mL得到含N浓度为6 nmol/pl的PEI溶液。取DNA溶液，稀释使其含P的浓度为1pg/pl，即3 noml/pl。2）配制不同N/P比的PEI/DNA复合物取PEI溶液30pl （即含N摩尔量为180nmol），加水270pl，配成300pl的P

5、EI溶液；取DNA母液30pl （即含P摩尔量为90nmol），加水270pl，配成300pl的DNA溶液；然后将上述的PEI溶液和DNA溶液涡旋混匀，得到N/P比为2:1的溶液，室温下静置30min，加生理盐水至总体积到5ml,加在比色皿中，然后用90Plus/BI-MAS （Brookhaven InstrumentsCorporation）测定颗粒的粒径。3）通过调整二者的加样体积（其中DNA的用量都是30艇），可以得到N/P比为5:1，8:1，10:1，15:1，20:1的PEI/DNA复合物。加样体积如下表：PEI与DNA的N/P比加PEI溶液体积（含N摩尔量）加水的体积加DNA溶液

6、体积（含P摩尔量）加水的体积2:130gl (180nmol)270gl30gl (90nmol)270gl5:175gl (450nmol)225 gl30gl (90nmol)270gl8:1120gl (720nmol)180gl30gl (90nmol)270gl10:1150gl (900nmol)150gl30gl (90nmol)270gl15:1225gl (1350nmol)75 gl30gl (90nmol)270gl20:1300gl (1800nmol)0gl30gl (90nmol)270gl4.作图。以N/P比值为横坐标，以粒径大小为纵坐标做图。分析不同N/P对粒径

7、大小的影响。五、数据处理1记录仪器上的粒径测定值，设置测定次数为5次，将所测定的数值进行筛选，平均值的误 差进算。2对数据进行作图。以N/P比值为横坐标，以粒径大小为纵坐标做图。分析不同N/P对粒 径大小的影响。下图是聚阳离子载体材料/DNA复合物的粒径分布图图3图3聚阳离子载体材料/DNA复合物的粒径分布图示意图ooooooooooo 0864208642 nz 11 1 1 1 1六、注意事项1聚乙烯亚胺与质粒DNA配置时要缓慢混合，如果滴加速度过快会造成局部过浓现象而出 现沉淀。2在配置完毕后，要注意时间的控制，放置30分钟后要立即测定，时间过长会出现聚集。七、思考题 在PEI溶液与DN

8、A溶液在混匀过程中，为什么要静置30min？时间过长或过短有什么影 响？常见的测量微粒粒径的方法有哪些？并简要阐述这几种方法各自的优缺点。概述仪器90Plus/BI-MAS除测定微粒的粒径外，还能在哪些方面进行应用？八、参考文献1.Michael Neu,Dagmar Fischer and Thomas KisselRecent advances in rational gene transfer vector design based on Poly(ethleneimine) and its derivatives. The Journol of Gene Medicine. 2005;7:992-10092 .JiYoung M.Dang, KamW.Leong. Natural polymers for gene delivery and tissue engineering Advanced Drug Delivery. 2006;58:487-4993.Tae Gw