建立PCR实验室的基本条件

1、建立 PCR 试验室的基本条件临床基因扩增试验室接受PCR 技术用于临床基因诊断,由于PCR 技术对所检测的核酸模板进行大量扩增,简洁消灭试验室污染导致临床检测标本假阳性结果；另外由于PCR 技术要求高、影响因素多（特殊是RNA 标本）,试验过程处理不当易导致核酸模板无扩增现象，导致临床标本假阴性结果.因此临床基因扩增检验试验室技术验收和规范化管理是PCR 技术本PCR 试验室验收预备工作（一）-试验室基本建设依据文件要求,临床基因扩增检验试验室原则上分为四个单独的工作区域:试剂贮存和预备闭分析仪器检测，此区域可不设。各工作区域必需有明确的标记，避开不同工作区域内的设备、物品混用。进入各工作区

2、域必需严格依据单一流向进行反应混合物配制和扩增区扩增产物分析区。不同的工作区域使用不同的工作服（不同的颜色。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。工作区域仪器设备配置标准试剂贮存和预备区 28和-15冰箱：混匀器；微量加样器(掩盖 11000l）;移动紫外灯（近工作台面高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心)；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等.标本制备区 28冰箱，-20或80水浴箱或加热模块；微量加样器（掩盖 11000l)；可移动紫外灯（近工作台面心管和加样器吸头（带滤心；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。扩增反应混合物配制和扩增区核酸扩增仪；微量加样器（掩盖1100；可移动紫外灯

3、（近工作台面)；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压 处理的离心管和加样器吸头(带滤心）;专用工作服和工作鞋;专用办公用品等。（掩盖1200l）;可移动紫外灯(近工作台面);耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）;专用工作服和工作鞋；专用办 公用品等.（上岗证培训与相关学问学习）1.临床基因扩增检验试验室的质量手册编写质量手册是阐明临床基因扩增检验试验室的质量方针，并描述过其质量体系的文件.质量手册规定了质量体系的基本结构，是实施和保持质量体系应长期遵循的文件.临床基因扩增检验试验室质量手册编写应依照卫生部下发两个文件,并结合本试验室实际状况编写适合本试验室的切实可行的质量手册。质量手册

4、的提纲应包括三部分：质量方针和宗旨；工作制度；标准操作文件（SOP）质量方针和宗旨制定临床基因扩增检验试验室的质量管理目标和质量保证体系的结构体系和总方针。工作制度一般应包括以下文件：试验室的设置、布局及组织结构；试验室内务管 理制度；试验室的人员配置及管理制度；生物的防护与平安制度；试验室废弃物处理制度； 试验室清洁消毒制度；仪器设备的管理制度；仪器、试剂、耗材购置程序及管理制度；临床标本的管理制度；试验室记录的管理制度;质量把握工作管理制度;结果报告管理制度；埋怨 的内部处理制度；负责人及质检员职责；岗位设置和责任制等标准操作程序（SOP)一般包括：消毒液配制标准操作程序：消毒标准操作程序

5、 ; 超净工作台使用标准操作程序；超净工作台维护和保养标准操作文件；PCR 仪使用标准操作程序；PCR 仪维护和保养标准操作程序；高速低温离心机使用标准操作程序;移液器使用标准操作程序;可移动紫外消毒车使用操作程序；加样器校准标准操作程序；离心机维护保 养操作程序；温度计校准程序；试剂的质检操作程序;标本唯一标识编号编制规章；临床标 本的病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序;结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测标准操作程序； 沙眼衣原体核酸扩增荧光检测标准操作程序等引用图表：PCR 扩增可接受标本记录表；PCR 扩增拒收标本记录表；室内质控结果记录表；室间质控记录表；消耗性材料验收记录表；试剂验收记录表；

6、故障处理表；台阶式高速离心机使用记录表；台式高速冷冻离心机使用记录表;扩增仪维护保养记录表;人员培 训方案及培训记录表；试验室工作人员一览表;主要设备一览表；试验室清洁消毒记录表； 工作区温度、湿度记录表；埋怨记录表；标本超低温保存记录表；应急处理记录表；垃圾处;设备校正记录表； 检测结果报告流程；报告单样张;临床送检标本流程图；试验室组织结构图.为了对以个特定序列进行PCR ,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面具体列出。1、样品预备区这个区域特地用作样品的预备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应当实行预防措施：PCR 产物和带有要扩增序列的DNA 克隆不能在这个房间操作。组织培育物、组织标

7、本和血清样品都带进样品预备间处理 ,以依据应用的需要提取DNA或RNA。用于样品处理的工具不能被用作一般分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。DNA 溶胶遗留.5)大体积样品应当用单独包装的无菌一次性移液管吸取。管子打开前都要简短离心以削减气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。,手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。试验服要特地用于样品预备间,经常清洗。2、样品预备和RNAPCRRNA-PCR 的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品预备区进行。在RNA-PCR 中应用 UNG 以防止污染的方法也有报道。3

8、、前PCR 区品预备的污染.PCR 区必需要有试剂和预备,PCR 区的正压活塞式移液管。4、PCR 试验室试剂的操作1)所用的全部溶液都应当没有核酸和（或)核酸酶（DNase RNase）污染.2）全部 PCR 试剂中使用的水都应当是高质量的新颖蒸馏的去离子水，用0。22m过滤的，并且是高压灭菌。3)在 20到 25贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品0。025%的叠氮钠不抑制扩增反应。4）所用试剂都应当以大体积配制，试验一下看试剂是否满足，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。5)全部试剂和样品预备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。新配制的试剂在用于预备新的标本之前

9、应当加以检验。样品预备和前PCR 区所使用的移液管在不使用时都应当当心保存.5、在前PCR 区建立PCR 混合物1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20或 4，在试验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用.2),可以考虑分装保存够一天的PCR 成分。 PCR样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物.阴性样品要与每组样品同时做,以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存 在 PCR 产物的污染，阴性对比应当包括核酸以外的全部试剂。当做阳性对比时，有两个理由打算了应当使用最少数量的核酸.由于必需有对比反应,对比模板的特点应当予以考虑。6、把握污染的方法已设计出很有力的酶

10、学方法用来消退一种形式的污染使用UNG,这一技术能有效地消退由PCR 产物引起的污染.另一种把握污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消退污染问题，但可以将污染降低几个数量级。7、PCR 仪的位置8、后PCR 区PCR 完成以后，需要分析样品并解释数据,应当留出一个特地用于反应后处理样品的地方。后PCR ,决不能把试验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR 活动。荧光定量 PCR 试验室所需仪器设备清单 （卫生部推举）序号 仪器设备、帮助材料名称 放置地点冰箱 试剂预备区紫外线消毒灯 试剂预备区混匀器 试剂预备区4 (10l（5-40ul，(2200ul一套三把试剂预备区高速台式离心机 试剂

11、预备区专用工作服和衣柜 试剂预备区冰箱 样品预备区紫外线消毒灯 样品预备区生物平安柜B2 级 样品预备区冷冻高速离心机（丙肝专用) 样品预备区恒温金属浴 样品预备区混匀器 样品预备区13 可调式移液器(5-40ul)， (20200ul) ，(2001000ul）一套 样品预备区专用工作服和衣柜 样品预备区紫外线消毒灯 PCR 扩增区和产物分析区(10，(40u，（2200ul一套 PCR 扩增区和产物分析区专用工作服和衣柜 PCR 扩增区和产物分析区荧光定量PCR 检测仪 PCR 扩增区和产物分析区全部四区均需预备的仪器设备为：专用工作服和工作鞋专用办公用品一次性手套、一次性吸水纸可移动紫外灯(近工作台面）微量加样器一套（掩盖 11000ul）以上物品各一套。试剂贮存和预备区28和15冰箱混匀器（可加热）耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）天平高压锅标本制备区28冰箱和-20或80冰箱