实验1普通光学显微镜的构造与使用

1、农业微生物学实验指导北京农学院食品科学系讲课教师刘一倩高秀芝2006年3月实验1显微镜的使用及细菌形态的察看1目的要求1认识一般光学显微镜的结构各部分的功能和使用方法。2学习并掌握油镜的原理和使用方法熟悉几种常有微生物的基本形态。2一般光学显微镜的结构与油镜的工作原理2.1一般光学显微镜的结构显微镜的结构可分为机械装置和光学系统两大多数。机械装置包含镜座、镜筒、镜臂、物镜变换器、载物台、推动器、粗调螺旋、微调螺旋、光圈等零件光学系统由接目镜、接物镜、聚光器、反光镜等构成图1-1。1镜座镜座是显微镜底座用以支撑全镜呈长方形。其上装有电源开关、照明光源、保险丝、光源滑动变阻器等。2镜筒镜筒上连结目

2、镜、下连结变换器光芒从筒中经过。安装目镜的镜筒分为可调式的单筒和固定式的双筒两种。从镜筒上缘到物镜变换器螺旋口之间的距离称为筒长。国际大将显微镜的标准筒长定为160mm此数字标在物镜的外壳上。3镜臂连结镜筒和镜座。有的镜臂是固定的有的可向后方倾斜其作用是支撑镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等。4物镜变换器变换器上可安装35个物镜一般是3个物镜低倍镜、高倍镜、油镜。转动变换器时能够按需要调动各样物镜将之推到使用地点上。图1-1光学显微镜结构表示图5载物台载物台呈长方形中央有一孔为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器。6推动器推动器由一横一纵两个推动齿轴和齿条构成转动其上螺旋可使标本片向前、后、左

3、、右挪动。研究型显微镜的纵横架杆上刻有刻度标尺构成精细的平面坐标系。如需要重复察看已检查标本的某一物像时可在第一次检查时记下纵横标尺的数值下次按数值挪动推动器就能够找到本来标本的地点。1.物镜变换器2.物镜3.游标卡尺4.载物台5.聚光器6.虹彩光圈7.光源8.镜座9.电源开关10.光源滑动变阻器11.粗调螺旋12.微调螺旋13.镜臂14.镜筒15.目镜16.标本挪动螺旋7粗调螺旋粗调螺旋用于粗放调理物镜和标本的距离。老式单目镜显微镜的粗调螺旋向前扭动镜头降落靠近标本。新式双目镜显微镜如Motic显微镜镜检时双手向后扭动使载物台上涨让标本靠近物镜反之则降落标本远离物镜。使用显微镜观查标本时主要

4、使用粗调螺旋调理。8微调螺旋用粗调螺旋只好粗放地调理焦距难于察看到清楚的物像因此需要用微调螺旋做进一步伐节。其每转一周镜筒挪动0.1mm。新式研究型显微镜粗、微螺旋为共轴式。原则上微调螺旋每次旋转不超过一周。9光圈在聚光器下方可随意开闭用来调理射入聚光器光芒强弱。10接目镜目镜作用是将物镜放大了的实像进行第二次放大形成虚像并映入眼帘。不一样的目镜上刻有5、10、15等字样以表示该目镜的放大倍数。一般光学显微镜常用的目镜主若是惠更斯目镜。研究型显微镜配有性能更好的目镜如赔偿目镜K、平场目镜P和广视场目镜WF等。照相时采纳照相目镜NFK。11接物镜物镜安装于变换器上入射光芒经过物镜时使被检物像形成

5、第一次放大的实像。一般显微镜装有低倍镜10、高倍镜40和油镜100三种消色差物镜外壳上标有“Ach”字样往常与惠更斯目镜配合便用。使用低倍镜和高倍镜时物镜与标本间的介质是空气称之为干燥系物镜。而使用油镜时物镜与标本间的介质是香柏油称之为油浸系物镜。油镜标有HI或Oil字样及镜头下缘刻有白环或红环。检查细菌标本要用油镜。研究型显微镜配有性能更好的物镜如复消色差物镜Apo、平场物镜Plan、平场消色差物镜PlanAch、平场复消色差物镜PlanApo等。12聚光器由聚光透镜、起落螺旋和能调理开孔大小的虹彩光圈构成装在载物台下边可经过起落螺旋而起落。其作用是将光芒聚光于标本之上加强照明度。一般光学显

6、微镜配置的都是明视场聚光器分为阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器三种。研究型显微镜如MoticBA400显微镜配有性能更好的消色差摇出式聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出知足低倍物镜4大视场照明的需要。齐明聚光器虽质量最好但不适于4倍以下的物镜。13反光镜初期一般光学显微镜常用自然光检视标本在镜座上装有反光镜由平凹两面镜子构成。光芒较强时用平面镜光弱时用凹透镜可自由旋转方向以将最佳光芒反射入聚光器。新式研究型显微镜镜座上装有光源并由电流调理螺旋来调理光照强度。2.2油镜使用的工作原理在显微镜的光学系统中物镜的性能直接影响显微镜的分辨率。与其余物镜对比油镜的放大倍数最大使用也比较特别需在载玻片与

7、镜头之间滴加香柏油这主要有以下二方面的原因1增添照光亮度油镜的放大倍数固然可达100但因焦距很短镜头直径很小进入镜头中的光芒亦较少故所需要的光照强度最大图1-2。当油镜头和标本玻片之间的介质为空气时因空气折射率n1.00与玻璃的折射率n1.55不一样会有一部分光芒被折射而不可以进入镜头内使视线更暗物像展现不清。若在镜头与标本玻片之间滴上与玻璃的折射率相仿的油类如香柏油n1.52等则光芒不发生折射进而增添了视线的照光亮度图1-3。图1-2物镜的焦距、工作距离和虹彩光圈的关系图1-3干燥系物镜A与油浸系物镜B的光芒通路2增添显微镜的分辨力显微镜的分辨力或分辨率是指显微镜能够鉴识两点之间最小距离的能

8、力。它与物镜的数值口径成正比与光波长度成反比。所以当光波波长一准时物镜的数值口径愈大则显微镜的辩解力愈大被检物体的细微结构也愈清楚地域别出来。分辨力可由以下公式表示分辨力最大可分辨距离/2NA式中为光波波长0.40.7?0?8mNA为物镜的数值口径值。它是光芒投射到物镜上的最大角度称为镜吵嘴的一半正弦与介质的折射率之乘积即NAnsin。式中为光芒最大入射角的多半它取决于物镜的直径和焦距。在实质应用中光芒入射角最大只好达到120?0?2其多半的正弦为Sin60?0?20.87。以空气为介质时NA1而以香柏油为介质时NA1.52故以香柏油为介质的油镜要比用空气为介质的高倍镜辩解力高因此细菌用油镜才

9、可察看到。但是显微镜的放大倍数越高其实不等于其分辨力越高。若是采用放大率为40的高倍镜NA0.65和放大率为24的目镜固然总放大率为960但其辩解力只有0.42?0?8m若采纳放大率为90的油镜NA1.25和放大率为9的目镜固然总放大率为810但却能分辨出0.22?0?8m之间的距离因此显微镜的总放大倍数越高其实不是其分辨力越高。3实验资料3.1菌种细菌三型、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、大肠杆菌Escherichiacoli等染色玻片标本。3.2溶液或试剂香柏油、二甲苯。3.3仪器与其余器具显微镜、擦镜纸等。4一般光学显

10、微镜的使用流程安置调光源调目镜调聚光器镜检低倍镜高倍镜油镜擦物镜头复原5操作步骤5.1察看前的准备显微镜的布置置显微镜于平坦的实验台上镜座距实验台边沿约10cm。镜检时姿势要正直。一般用左眼察看右眼画图或记录两眼同时张开以减少眼睛疲惫。光源调理安装在镜座内的光源灯可经过调理电压以获取适合的照明亮度。反光镜收集自然光或灯光作为照明光源时较强的自然光源用平面镜较弱的照明光源用凹透镜并调理其角度使视野内的亮度适合、平均。凡检查染色标本光阴线应强检查未染色标本光阴线不宜太强可经过光圈、聚光器、反光镜调理适合的光芒。双筒显微镜的目镜调理依据使用者的个人状况双筒显微镜的目镜间距能够适合调理而左目镜上一般还

11、配有屈光度调理环能够适应眼距不一样或两眼视力有差异的不一样察看者。聚光器数值孔径值的调理正确使用聚光镜才能提升镜检成效。聚光镜的主要参数是数值孔径它有必定的可变范围一般聚光镜边框上的数字是代表它的最大数值孔径经过调理聚光镜下边可变光阑的开放程度可以获取各样不一样的数值孔径以适应不一样物镜的需要。5.2显微镜察看一般状况下特别是初学者进行显微镜察看时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的察看程序。因为低倍数物镜视线相对较大易发现目标和确立检查的地点。低倍镜察看将标本片置于载物台上用弹簧夹固定挪动推动器使察看对象处于物镜正下方。旋动粗调螺旋使物镜与标本片距离约lcm单镜筒显微镜或0.5cm双镜筒显微镜再

12、以粗螺旋调理使镜头迟缓升起单镜筒或使载物台迟缓降落双镜筒直到物像出现后再用微螺旋调理使物像清楚。而后挪动标本玻片将察看目标移至视线中心后认真察看与画图。高倍镜察看由低倍镜直接变换成高倍镜至正下方。变换时需用眼睛于侧面察看防止镜头与玻片相撞。调理聚光器和光圈使视线亮度适合尔后微调细螺旋使物像清楚。利用推动器挪动标本找到需要察看的部位并移至视线中心认真察看或准备用油镜察看。油镜察看先将光圈开至最大集光器升至最高位调理好光源使照光亮度最强。在高倍镜或低倍镜下找到要察看的样品地区后用粗调理螺旋将镜筒远离载物台而后在标本上滴加香柏油切勿过多不然视线模糊变换油镜头从侧面凝视当心将之浸入油滴中使其几乎与标本

13、片相接触为度注意切不行将油镜镜头压到标本不然不单压碎玻片还会破坏镜头。用粗螺旋迟缓升起镜筒单镜筒或降落载物台双镜筒至物像出现后再以细螺旋调至物像清楚。假如油镜已走开油面而仍未见物像可再将镜头浸入油中重复以上操作至物像清楚为止。5.3显微镜用后的办理察看完成台起镜头立刻用擦镜纸擦去镜头上的油再用擦镜纸蘸取少量二甲苯香柏油溶于二甲苯或乙醚乙醇混淆液擦去镜头上的残留油迹最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。禁止用手或其余纸擦镜头免得破坏镜头。用绸布洁净显微镜的金属零件。将各部分复原将物镜转成“八”字形再将载物台降落至最低降下聚光器免得与物镜相撞反光镜垂直于镜座。套上镜套放回柜内或镜箱中。6实验结果与报告1

14、分别绘出用油镜察看到的细菌的形态图。注意察看它们的个体形态、大小、摆列方式。有芽孢的细菌察看其菌体两头状况及芽孢着生地点。7思虑题1察看细菌时为何使用油镜它与干燥系物镜使用方法有何不一样使用时注意哪些问题2一般光学显微镜的目镜与物镜的常用放大倍数有几种显微镜的放大倍数越高辩解力越高吗为何举例说明。3试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差别。为何在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调理螺旋的误操作4依据实验领会商谈应如何依据所察看微生物的大小选择不一样的物镜进行有效的察看。实验2细菌的革兰氏染色及其形态察看1目的要求1认识革兰氏染色法的原理及其在细菌分类判定中的重要性。2学习掌握革兰氏染色技术

15、进一步娴熟光学显微镜油镜的使用技术。2基来源理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴识染色法。依据细菌细胞壁的结构和化学构成的不一样经革兰氏染色后体现不一样的染色反响可将全部细菌划分为两大类即革兰氏阳性菌用G表示和革兰氏阴性菌用G-表示。当细菌用结晶紫初染后像简单染色法同样全部细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂它能与结晶紫联合成结晶紫碘的复合物进而加强了染料与细菌的结协力。染色要点在于脱色剂的脱色作用。当用乙醇或丙酮办理时两类细菌的脱色成效是不同的。G细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构构成壁厚、类脂质含量较低用乙醇或丙酮脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径减小透性降低进而使结晶紫碘的

16、复合物不易被洗脱而保存在细胞内经脱色和复染后仍保存初染剂的蓝紫色。G-细菌则不一样因为其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量较高所以当脱色办理时类脂质被乙醇或丙酮溶解细胞壁通透性增大使结晶紫碘的复合物比较简单被洗脱出来用复染剂复染后细胞被染上复染剂的红色。3实验资料3.1菌种大肠杆菌Escherichiacoli约24h营养琼脂斜面培育物枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis或蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus约1820h营养琼脂斜面培育物。3.2染色剂草酸铵结晶紫染色液、鲁格尔氏碘液、95乙醇、0.5番红沙黄染色液。3.3仪器与其余器具显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶内装香柏油和二

17、甲苯因二甲苯有毒及简单破坏镜头可用乙醚乙醇混淆液代替二甲苯、生理盐水、擦镜头纸、吸水滤纸、纱布、火柴、玻璃铅笔、玻片夹或镊子等。4实验流程涂片干燥固定草酸铵结晶紫初染1min水洗碘液媒染1min水洗95乙醇脱色30s水洗沙黄复染1min水洗滤纸吸干镜检5操作步骤5.1制片取菌种培育物按简单染色法中的惯例涂片、干燥、固定进行制片。注意要用活跃生长久的幼龄培育物做革兰氏染色。5.2初染在涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫适当以恰好将菌膜覆盖为宜染色12min倾去染色液细水冲刷至洗出液为无色。5.3媒染滴加碘液于涂片上作用1min水洗。5.4脱色用滤纸吸去玻片上的残水滴加95酒精于涂片上轻轻摇动玻片直至乙醇

18、脱色恰好不出现紫色为止一般30s如牛乳培育物用60s后立刻水洗停止脱色。5.5复染沙黄复染12min水洗。5.6镜检用滤纸吸干或自然干燥油镜检查。G菌呈蓝紫色G-菌呈红色。革兰氏染色的注意事项涂片不宜过厚勿使细菌密集重叠影响脱色成效不然脱色不完好造成假阳性。镜检时应以视线内分别细胞的染色反响为标准。火焰固定不宜过热以玻片不烫手为宜不然菌体细胞变形。滴加染色液与酒精时必定要覆盖整个菌膜不然部分菌膜未受办理亦可造成设想。乙醇脱色是革兰氏染色操作的要点环节。如脱色过度则G菌被误染成G-菌而脱色不足G-菌被误染成G菌。在染色方法正确无误前提下如菌龄过长死亡或细胞壁受损害的G菌也会呈阴性反响故革兰氏染色

19、要用活跃生长久的幼龄培育物。6示范在示范镜下察看大肠杆菌图2-1a、枯草芽孢杆菌图2-1b、金黄色葡萄球菌图2-1c、藤黄微球菌图2-1d、钩端螺旋菌图2-1e、副溶血性弧菌图2-1f的形态及排列方式。abcdef图2-1各样细菌在光学显微镜下的形态10007实验结果与报告依据察看结果按比率大小绘出革兰氏染色制片中细菌的形态图并说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反响。8思虑题1详叙革兰氏染色的原理及操作方法染色时应注意哪些问题2哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性此中最要点的环节是什么3不经过复染这一步可否差别G菌和G-菌4为何要求制片完好干燥后才能用油镜察看5当你对未知菌进行革兰氏染色时如何保

20、证操作正确结果靠谱实验3霉菌形态及菌落特点的察看1目的和要求1学习并掌握察看四类常有霉菌形态特点的基本方法。2掌握青霉、曲霉的小室载片培育法以便更好地察看其个体形态。3察看霉菌的平板菌落特点认识霉菌的菌落特点在丝状真菌形态学判定上的重要性。2基来源理霉菌是由复杂的菌丝体构成。它分为基内菌丝或营养菌丝、气生菌丝或生殖菌丝由生殖菌丝产生孢子。霉菌的生殖菌丝及孢子的形态特点是辨别不一样种类霉菌的重要依照。察看霉菌的形态常用的有以下三种方法乳酸石炭酸棉蓝浸片法是将培育物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中制成霉菌制片。因为霉菌菌丝较粗大概为310?0?8m置于水中察看时菌丝简单缩短变形故常用乳酸石炭酸棉兰染色液

21、制片使细胞不会变形染液的蓝色能加强反差并拥有防腐、防干燥、防备孢子飞散作用能保持较长时间必需时还可用光学树胶封固制成永远标本长久保存。但用接种针或小镊子挑取菌丝体时菌体各部分结构在制片刻易被破坏不利于察看其完好形态。小室载玻片培育法用无菌操作将培育基琼脂薄层置于载玻片上接种后盖上盖玻片培育霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培育一准时间后将载玻片上的培育物置显微镜下察看。这类方法能够保持霉菌自然生长状态便于察看到霉菌完好的营养随和生菌丝体的特化形态比如曲霉的足细胞、顶囊青霉的分生孢子梗、根霉的爬行枝、假根等。别的也便于察看不一样生长时期的培育物。玻璃纸培育法其操作方法与放线

22、菌的玻璃纸培育察看方法相像。此种方法用于察看不一样生长阶段霉菌的形态亦可获取优秀成效。霉菌在固体培育基上生长呈棉絮状毛霉、蜘蛛网状根霉、绒毛状曲霉和地毯状青霉的菌落。其生殖方式多为无性生殖和少为有性生殖。霉菌的菌丝体及其菌落形态特点是霉菌分类、判定的重要依照。3实验资料3.1菌种黑曲霉、产黄青霉、黑根霉和总状毛霉2830培育35d的PDA或麦芽汁斜面和平板培育物点植接种、培育根霉假根的PDA平板培育物、培育霉菌的小室载玻片培育物。3.2培育基马铃薯葡萄糖PDA琼脂培育基、麦芽汁琼脂培育基。3.3试剂与染色剂乳酸石炭酸棉蓝染色液、50乙醇、20甘油保湿剂、无菌生理盐水。3.4仪器与其余器具接种环

23、、接种钩、解剖针、解剖刀、镊子、酒精灯、载玻片、盖玻片、透明胶带、圆形滤纸片、U形玻璃棒、无菌平皿、无菌细口滴管、格尺、一般光学显微镜、体视显微镜、恒温培育箱等。4操作步骤4.1霉菌的形态观擦乳酸石炭酸棉蓝浸片法在载玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液用解剖针或小镊子从霉菌菌落边沿处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝先置于50乙醇中浸一下以洗去零落的孢子再置于载玻片上的染液顶用解剖针当心地将菌丝分别开。盖上盖玻片注意勿压入气泡和挪动盖玻片免得影响察看置于低倍镜和高倍镜下察看四类霉菌内容以下根霉用低倍镜察看孢子囊梗囊轴等用高倍镜察看孢子囊孢子的形状大小。将根霉斜面培育物置于显微镜载物台上用低倍镜察看根霉的孢子囊柄、孢子囊、假根和爬行枝。图3-1小室载玻片培育法表示图毛霉用低倍镜察看孢子囊梗囊轴等用高倍镜察