实验五拟南芥插入突变纯合体的鉴定

1、关于实验五拟南芥插入突变纯合体的鉴定第1页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三实验目的1熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法；2掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变体的方法。 第2页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三T-DNA插入鉴定的原理第3页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三突变体鉴定的步骤T-DNA插入基因的基因组序列；T-DNA插入方向的确定；T-DNA插入位置的确定；引物设计；PCR扩增；电泳检测。第4页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三T-DNA插入基因的基因组序列第5页，共20页，2

2、022年，5月20日，22点10分，星期三点击基因编号进入网页第6页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三点击sequence viewer进入第7页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三点击nucleotide view进入 第8页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三点击突变体编号后进入的网页第9页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三进入网站/cgi-bin/tdnaexpress查找基因突变体及插入方向第10页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三第11页，共20页，2022年，5月20日，22点

3、10分，星期三基因方向T-DNA方向5引物3引物实验设计第12页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三引物设计基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥网站/tdnaprimers.html进行自动生成，也可以根据自己的需要进行设计。一般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位置300bp以上为宜，即300+N bp。LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines：TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 第13页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三植物基因组DNA的快速提取 （1）取植物叶片（拟南芥一片叶子），置于1.5ml离心管中，

4、加入400 ml提取缓冲液；（2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色；（3）在台式离心机上13000 rpm离心5分钟；（4）离心后将上清300 ml转移至一个新的1.5 ml离心管中；（5）在上清中加入300 ml异丙醇，混匀后于室温下13000 rpm条件下，离心5分钟；（6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀；（7）100 ml TE溶解沉淀，将制备好的样品在4保存备用。（此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增）第14页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三PCR鉴定 30ml反应体系： 2ml 植物基因组DNA

5、样品 3ml 10扩增缓冲液 0.5ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 引物1（10 mmol/L） 1ml 引物2（10 mmol/L） 用无菌水补足体积。第15页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三PCR反应条件94 3min30循环（94/1min，55/1min，72/1min）； 72 延伸10min。注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和引物的性质进行合适的调整。第16页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三PCR安排每小组四个PCR反应，引物和DNA模板分别如下： 1.WT基因组模板2个P

6、CR反应：引物分别为基因自身的5和3端引物；5引物和LBa引物。2.突变体基因组为模板2个PCR反应：引物分别为基因自身的5和3端引物；5引物和LBa引物。第17页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三046号突变体的鉴定（1-6组） 30ml反应体系1： 2 ml 植物基因组DNA样品（WT） 3 ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 1 ml 046 5引物（10mmol/L） 1 ml 0463引物（10mmol/L） 30ml反应体系2： 2 ml 植物基因组DNA样品WT 3 ml 10扩增缓冲

7、液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1 ml 046 5引物（10 mmol/L） 1 ml LBa 引物（10 mmol/L） 30ml反应体系3： 2 ml 植物基因组DNA样品（111） 3 ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 1 ml 046 5引物（10mmol/L） 1 ml 0463引物（10mmol/L） 30ml反应体系4： 2 ml 植物基因组DNA样品（111） 3 ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 m

8、l dNTP（10 mmol/L） 1 ml 046 5引物（10 mmol/L） 1 ml LBa 引物（10 mmol/L） 第18页，共20页，2022年，5月20日，22点10分，星期三135号突变体的鉴定（7-11组） 30ml反应体系1： 2ml 植物基因组DNA样品（WT） 3ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5引物（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 30ml反应体系2： 2ml 植物基因组DNA样品（WT） 3ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 1ml LBa 引物（10 mmol/L） 30ml反应体系3： 2ml 植物基因组DNA样品（111） 3ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5引物（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 30ml反应体系4： 2ml 植物基因组DNA样品（111） 3ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml