灵芝活性多糖的提取工艺研究

1、灵芝活性多糖的提取工艺研究【摘要】目确实立水提醇沉法与超声提取法相结合提取灵芝活性多糖的最正确工艺。方法以脾细胞代谢TT活力为评价指标，采用正交试验对超声时间、水提温度和水提时间等因素进展考察，寻求最正确的提取工艺。结果各因素对灵芝多糖脾细胞代谢TT活力的影响大小排列为:超声时间水提温度水提时间,超声时间对灵芝多糖活性影响显著。提取最正确工艺为：超声提取时间20in，水提取温度80，水提取时间2h。结论本工艺为提取活性灵芝多糖提供了一定的参考。【关键词】灵芝多糖;脾细胞;提取工艺;正交试验Abstrat:bjetiveTexplreanptiuextratinpredure(aterextra

2、tinalhlpreipitatinandultrasniextratinethd)fativeplysaharidesfrGanderaluidu.ethdsByusinglrietriethylthiazlyltetrazliu(TT)assayfspleniellsfieasevaluatinindiatr,rthgnaltestasndutedtevaluateultrasniextratintie,aterextratinteperature,andaterextratintietexplretheptialextratinpredure.ResultsTheaininfluenin

3、gfatrsflrietriethylthiazlyltetrazliu(TT)assayfspleniellsfieereultrasniextratintie，aterextratinteperature，andaterextratintieinturn.Theptialnditinsfrthgnalexperient：ultrasniextratinfr20inutes,aterextratinat80fr2hurs.UltrasniextratintiehadsignifianteffetnextratinfativeplysaharidesfrGanderaluidu.nlusinT

4、hetehnlgyprvidedreferenesfrextratinfativeplysaharidesfrGanderaluidu.Keyrds:Ganderaluiduplysaharides;spleniells;extratinpredure;rthgnalexperients灵芝是我国传统的补益中药，现代研究说明灵芝多糖是其主要活性成分之一，灵芝多糖具有抗肿瘤及免疫调节作用1，2。灵芝多糖提取方法有传统的水提醇沉法3，4、超声波法4-6、酶法，还有冷冻预处理法、超声波催化纤维素酶法、超临界萃取法等。灵芝多糖的活性在不同的提取工艺中变化很大，提取率高并不意味其有效活性高。现有文献对灵

5、芝多糖提取工艺的研究未与其活性联络起来。本文拟采用水提醇沉法和超声波法相结合提取灵芝活性多糖，应用正交试验法设计试验，讨论提取工艺中影响因素对多糖活性的影响，采用小鼠脾细胞增殖实验检测多糖的免疫活性，确立优化的提取工艺。1实验材料1.1动物1.2材料灵芝(产地：广西，批号：20220101，广州市药材公司中药饮片厂)。1.3仪器1.4试剂95%乙醇(广东广宁县葡萄糖药业，批号：20221101);葡萄糖、硫酸等试剂均为分析纯;重蒸苯酚(南方医科大学化学教研室);RPI1640培养基(GIB公司产品);噻唑兰(TT)、nA(刀豆蛋白A)均为Siga公司产品。2方法2.1正交试验设计根据文献报道，

6、超声提取时间(因素A)、水提取温度(因素B)、水提取时间(因素)对灵芝多糖的提取影响较大，最正确的提取条件在一定范围之内，超声时间为2040in，提取时间为1.53h，提取温度为801006-8。根据预实验及文献，本文正交试验对上述三因素，每个因素设三程度进展考察，以脾细胞代谢TT活力作为考察指标。根据正交试验的综合评分选择最正确方案。正交设计选用L9(34)正交表，见表1。2.2提取方法精细称取灵芝粉50g置圆底烧瓶中，参加10倍量乙醇，70水浴回流30in作预处理，过滤，滤渣置圆底烧瓶中，参加15倍量水后按照正交程度表进展试验，先进展超声(因素A)处理，超声完成后，放入恒温水浴器内，按照提

7、取温度(因素B)和时间(因素)条件的三程度平行操作，水提完成后过滤，滤液于210冷藏放置过夜，抽滤，滤液减压浓缩至约100L，参加3倍量乙醇，210冷藏放置过夜，抽滤，沉淀用100L热水溶解，水浴蒸至稍干后60恒温枯燥，得水溶性粗多糖，精细称量后计算多糖提取率和含量。表1正交试验的因素程度表2.3多糖的测定2.4脾细胞代谢TT活力测定取安康BALB/小鼠，脱颈椎处死，无菌取出脾脏，常规制备脾细胞悬液,用含10%新生牛血清RPI1640培养液(以下简称全培)调整细胞浓度为8106个/L,在已加好待测样品或者对照试剂的96孔板中每孔参加上述细胞悬液100L。使总体积为200L，置培养箱中在饱和湿度

8、、5%2、37条件下培养48h。小鼠脾细胞培养完毕前4h，每孔参加0.25%TT(生理盐水配制)20L，继续培养4h，然后每孔加二甲基亚砜100L，振摇2in使TT的紫色复原产物完全溶解。最后用酶标仪在570n处测定光密度，结果用570n处的吸光度值(A)表示。2.5统计分析采用SPSS13.0统计软件中的正交设计方差分析法对数据进展统计分析。转贴于论文联盟.ll.3结果正交试验结果见表23。从表2中脾细胞代谢TT活力极差(R)可知，影响因素主次顺序为AB，各因素的最正确程度分别为A123，B123，213;从表3方差分析结果可见，除A因素对脾细胞代谢TT活力有显著性影响外，其他因素均无显著性

9、影响。综合以上结果，确定最正确提取工艺为A1B12，即超声提取时间20in，水提取温度80，水提取时间2h。表2正交试验结果表3方差分析(根据多糖脾细胞代谢TT活力)4讨论4.2超声20in的脾细胞代谢TT活力比30in和40in的高。原因是超声波具有较强的机械剪切作用，长时间作用使多糖构造破坏，导致多糖活性下降。另外，超声时间过长，细胞进一步破碎，杂质溶出去杂质时造成多糖损失，这也是多糖提取率有所下降的原因之一。4.3水提时间2h的脾细胞代谢TT活力比1h和3h的高;水提温度80的脾细胞代谢TT活力比90和100的高。原因是提取时间增加，促进细胞的多糖物质向外扩散，但随着时间和温度进一步增加

10、，细胞破碎程度过大，长时间热水提取，多糖分子容易受热分解，使多糖活性有所下降。4.4有文献报道有关灵芝多糖有水不溶性多糖、水溶性多糖、酸性多糖、碱性多糖等10，11。本文的提取工艺可能使一局部多糖，如水不溶性多糖，在乙醇的预处理和热水提取后参加乙醇沉淀的过程中被弃去，得到的主要是水溶性多糖，因此这可能是本文实验中的灵芝多糖提取率比文献报道8，10要低的原因之一。【参考文献】1戴那么林，董昌武.灵芝多糖的生物活性研究进展J.安徽中医学院学报，2022，24(5):60-62.2宁安红，曹婧，黄敏等.灵芝多糖对荷瘤小鼠肿瘤免疫系统的影响J.中国微生态学杂志，2022，16(1):16-17.3李艳，赵海燕，率建宁.灵芝多糖提取工艺研究J.中成药，2022，28(7):1052-1054.4胡斌杰，陈金锋，王宫南.超声波法与传统热水法提取灵芝多糖的比拟研究J.食品工业科技，2022，28(2):190-192.5郭孝武.超声技术在中草药成分提取中的应用J.中草药，1993，24(10):548.6徐凌川，张华，许兴盛，等.超声波提取灵芝多糖的最正确工艺讨论J.中国中药杂志，2022，30(6):471-472.7刘英梅，李春华，陈鸿雁.灵芝孢子粉中多糖提取工艺的研究J.中成药，2022，28(3):332-335.8罗立新，姚汝华，周少奇.灵芝多糖的别离与纯化J.食品工业科技，19