化验技术协会第八期企业知识管理培训资料

1、*化验技术协会第八期培训资料（微生物检定工）*无菌检查法 无菌检检查是检查要要求无菌的药药品、医疗器器具、原料、辅辅料及要求无无菌的其他物物品是否染有有活菌的一种种方法。事实实上，若供试试品符合无菌菌检查法的规规定，仅表明明了供试品在在该检验条件件下未发现细细菌和真菌污污染。 无菌检检查法有薄膜膜过滤法、直直接接种法两两种方式。细细菌培养温度度32.52.5，真菌培养养温度25.52.5。 1 无菌检查的的环境 无菌检检查的所有操操作均需在严严格控制微生生物污染的环环境下进行，操操作环境的无无菌保证程度将直接影响无无菌检查结果果，为了保证证无菌检查用用洁净室(区区)环境的稳稳定性，确保保检查结

2、果的的可靠性，对对洁净室(区区)的环境质质量采取合理理的控制措施施和评价方法法是必要的。无无菌检查应在在环境洁净度度100000级和局部洁洁净度1000级的单向流流空气区域内内或隔离系统统中进行，其其全过程必须须严格遵守无无菌操作，防防止微生物污污染。单向流流空气区、工工作台面及环环境应定期按按医药工业业洁净室(区区)悬浮粒子子、浮游菌和和沉降菌的测测试方法的的现行国家标标准进行洁净净度验证。隔隔离系统按相相关的要求进进行验证，其其内部环境的的洁净度须符符合无菌检查查的要求。 无菌室室应采光良好好、避免潮湿湿、远离厕所所及污染区。面面积一般不超超过lOm22，不小于55m2,高度不超过22.4

3、m。由112个缓冲冲间、操作间间组成(操作作间和缓冲间间的门不应直直对)，操作作间与缓冲间间之间应具备备灭菌功能的的样品传递箱箱。在缓冲间间内应有洗手手盆、毛巾、无无菌衣裤放置置架及挂钩、拖拖鞋等，不应应放置培养箱箱和其他杂物物；无菌室内内应六面光滑滑平整，能耐耐受清洗消毒毒。墙壁与地地面、天花板板连接处应呈呈凹弧形，无无缝隙，不留留死角。操作作间内不应安安装下水道。 无菌操操作室应具有有空气除菌过过滤的单向流流空气装置，操操作区洁净度度100级或或放置同等级级别的超净工作台台，室内温度度控制1826，相对湿度度45665。缓冲冲间及操作室室内均应设置能达到空气气消毒效果的的紫外灯或其其他适宜

4、的消消毒装置，空空气洁净级别别不同的相邻邻房间之间的的静压差应大大于5Pa，洁洁净室(区)与室外大气气的静压差大大于lOPaa。无菌室内内的照明灯应应嵌装在天花花板内，室内内光照应分布布均匀，光照照度不低于3300lx。缓缓冲间和操作作间所设置的的紫外线杀菌菌灯(222.5Wm3)，应定期期检查辐射强强度，要求在在操作面上达达40Wcm-2。不符合合要求的紫外外杀菌灯应及及时更换。 无菌室室应每周和每每次操作前用用0.1新洁洁尔灭或2甲酚液或其其他适宜消毒毒液擦拭操作作台及可能污染的的死角，开启启无菌空气过过滤器及紫外外灯杀菌1小小时。在每次次操作完毕，同同样用上述消毒溶液擦擦拭工作台面面，除

5、去室内内湿气，用紫紫外灯杀菌半半小时。 无菌室室的洁净度检检查 无菌室在消消毒处理后，无无菌试验前及及操作过程中中需检查空气气中菌落数，以以此来判断无无菌室是否达达到规定的洁洁净度，常有有沉降菌和浮浮游菌测定方方法。 沉降菌菌检测方法及及标准 以无菌方方式将3个营营养琼脂平板板带入无菌操操作室，在操操作区台面左左、中、右各各放1个；打打开碟盖扣置置，平板在空空气中暴露330分钟后将将碟盖盖好，置置3252.5培养48小小时，取出检检查，3个平平板上生长的的菌落数平均均不超过1个个。 浮游菌菌检测方法及及标准 用专门的的采样器，宜宜采用撞击法法机理的采样样器，一般采采用狭缝式或离心式采样样器，并

6、配有有流量计和定定时器，严格格按仪器说明明书的要求操操作并定期校校验，采样器器和培养皿进进入被测房间间前先用消毒毒房间的消毒毒剂灭菌，使使用的培养基基为营养琼脂脂培养基或药药典认可的其其它培养基。使使用时，先开开动真空泵抽抽气，时间不不少于5分钟钟，调节流量量、转盘、转转速。关闭真真空泵，放入入培养皿，盖盖上采样器盖盖子后调节缝缝隙高度。置置采样口于采采样点后，依依次开启采样样器、真空泵泵，转动定时时器，根据采采样量设定采采样时间。全全部采样结束束后，将培养养皿置32.52.5培养48小小时，取出检检查，浮游菌菌落数平均不不得过5个m3。 每批培培养基应选定定3只培养皿皿做对照培养养。 无菌操

7、作作台面或超净净工作台还应应定期请有关关部门检测其其悬浮粒子，应应达到lOOO级(一般用尘埃粒子计数数仪)检测尘尘埃粒径0.5m的粒数不不得超过3.5个升，5m的粒数为为0,空气流流速应0.35ms，可根据据无菌状况必必要时置换过过滤器。 2 仪器及用具具 2.11 无菌室室内应准备好好盛有消毒用用5甲酚或或其他适宜消消毒溶液的玻玻璃缸、乙醇醇灯、火柴、镊子、775乙醇棉棉、碘伏棉等等。 恒温培养箱箱及生化培养养箱。 离心机、生生物显微镜、真真空架、高压压蒸汽灭菌器器、标准pHH比色器(00.02酚磺磺酞指示液和溴麝香香草酚蓝指示示液)、恒温温烤箱、开放放或全封闭过过滤系统。2.4 玻璃璃器皿

8、 试试管、量筒、三三角瓶、移液液管、刻度吸吸管(1、55、10mll)、注射器器(2、5、lOml)、双双碟等，用玻玻璃洗涤剂或或清洁液浸泡泡，水洗3次次。如使用过过程中与细菌菌接触(已污污染)，应先先灭菌倒出内内容物后再清清洗，晾干。凡凡无菌操作过过程中所用的的器皿，都应应用牛皮纸包包扎严密，灭灭菌。移液管管、刻度吸管管在管内上端端，塞少许原原棉，以手感感不松不紧为为宜，然后放放于吸管筒内内或牛皮纸袋袋内，封严，灭灭菌待用；试试管、离心管管、三角瓶等等在管(瓶)口塞上海棉棉胶(或硅胶胶)专用塞或或纱布棉塞，塞塞子应塞进管管口内2/33处，用牛皮皮纸将管口(包括塞子)包扎严，灭灭菌待用；将将注

9、射器、针针头(9号、111号、12号)配对，检查查针头是否畅畅通后，将注注射芯、管和和针头分别放放在双层纱布布(或布)内内，包扎严密密，置带盖容容器(瓷盘或或铝制饭盒)内，盖严，用用牛皮纸包扎扎后，灭菌待待用。长柄取取样匙，放于于不锈钢长筒筒内，盖严，干干热灭菌待用用。手术镊、手手术剪洗净、擦擦干。用双层层纱布将1把把剪刀与1把把镊子间隔包包扎在一起，放放于带盖的容容器（瓷盒或或铝制饭盒)内，盖严，用用牛皮纸包扎扎，灭菌(参参照附录XVV灭菌法)待待用。高压蒸蒸汽灭菌的物物品取出时切切勿立即置冷冷处，避免因因急速冷却，使使灭菌物品内内蒸汽冷凝造造成负压，易易染菌，取出出后应置恒温温培养箱(或或

10、干燥箱)中中烘干，待用用。2.5 无菌菌衣、裤、帽帽、口罩等洗洗净晾干，配配套，用牛皮皮纸包严，灭灭菌待用或用用一次性的无菌物品代替替。 2.66 除菌滤器器及滤膜 有多种开放放式及封闭式式滤器用于过过滤除菌。微微孔滤膜直径径50mm、孔径约约0.45m。新购入入封闭式滤器器或滤膜，需需进行孔径大大小的测试，一一般有三种方方法，其中一种方法即即可。 气泡法法 先将滤滤膜浸入水中中，使完全湿湿润，然后用用镊子夹住一一片滤膜放于于气泡点测定定装置或滤膜膜孔径测定仪仪上，膜上放放一块与滤膜膜大小相同的的尼龙筛网，再再加上多孔板板，将螺旋固固定圈旋紧，在在多扎板上加加35mmm深的水(注注意排除气泡泡

11、)关闭放气气阀，启动空空压机或氮气气瓶阀，使压压力缓缓上升升，注意观察察水面上产生生第一个气泡泡时，记录压压力表的压力力，气泡点压压力不应小于于2.2kgg/cm2(0.2MPa)。水流量法 将将滤膜装于除除菌滤器上，开开动真空泵，压压力在7000mmHg(93kPaa)下，抽滤滤已滤清的水约5000ml，计算出每每lmin的的滤速。20005年版中中国药典对滤滤膜的滤速未未明确规定，而而USP规定定在700mmmHg(993kPa)压力下，滤滤膜直径477mm；流速速55755mlmiin。细菌过滤法 常用的细菌菌为粘质沙雷雷氏菌，将该该菌的新鲜营营养琼脂斜面面培养物，接接种于营养肉汤培养基

12、基中，32.52.5，培养18820小时，用用0.9无菌氯氯化钠溶液稀稀释至10-3 (约相相当于7105cffum1)，取此菌液液1ml加至50mml 0.9无菌氯氯化钠溶液中中，按薄膜过过滤法过滤，取取该滤液5mml接种于营养养肉汤培养基基40ml中中，32.52.5培养24小时,应无菌生长长。不符合规规定的滤膜不不得使用。 3 菌种及菌液液制备 菌种的的传代次数不不得超过5代代(从菌种保保藏中心获得得的冷冻干燥燥的菌种为第第0代；冷冻干干燥的原始菌菌种开启后转转种，为第一一代)。原始菌种购到后后，应由专人人负责，接收收菌种时应检检查安瓿的数数量和菌种的的名称及每一一支安瓿的完整性。并并在

13、相应的菌菌种接收登记记表上记录所所有关于菌种种的信息。将将安瓿存于-20，使用时首首先需要复活活冻干菌种(按菌种保藏藏中心提供相相关资料操作作)，一般包包括以下步骤骤：冷冻菌种的复活活 清洁安安瓿(可用775的酒精精或碘伏)后后，用砂轮在在安瓿上部三三分之一处划痕，用干燥燥的无菌纱布布包裹安瓿，将将安瓿掰开，用用一无菌吸管管吸取适量00.50.8ml的液体培养养基(生孢梭梭菌用液体硫硫乙醇酸盐培培养基；金黄黄色葡萄球菌菌、大肠埃希希菌、铜绿假假单胞菌和枯枯草芽孢杆菌菌用营养肉汤汤；白色念珠珠菌、黑曲霉霉菌用液体真真菌培养基)滴加到安瓿瓿中，轻轻旋旋转安瓿并吹吹打，使冻干干菌种和液体体培养基充分

14、分混和并完全全溶解，再将将安瓿内的菌菌悬液全部吸吸出，转移至至相应的培养养基试管中，根根据菌种类型型采用适宜的的培养条件(细菌培养温温度32.52.5，18224小时；真真菌培养温度度25.52.5，35天天)下培养，观观察培养基是是否浑浊，(如不浑浊，细细菌应延长培培养时间至77天以上，真真菌应延长培培养时间至114天以上，仍仍未浑浊，按按相关规定灭灭菌处理。)浑浊说明菌菌种复活生长长，在应用前前，还应确认认菌种的纯度度和特性。菌种确认 用用无菌接种环环取上述培养养物，在相应应的培养基平平板上划线分分离单个菌落落，适宜条件下培养。培培养后观察是是否具有典型型的菌落形态态，然后挑取取单一的纯菌

15、菌落，进行革革兰染色、镜镜检，观察其其染色特性及及菌形。并作作生化实验或或使用菌种鉴鉴定系统进一一步鉴定该菌菌种。对已通通过确认鉴定定后的菌种可可以使用或传传代保藏。菌种传代保藏方方法很多，各各单位可根据据情况采用，但但无论应用何何种方法，都都应对采用的的方法进行验证，确确保在相应保保存条件下的的菌种不会变变异且性能稳稳定，同时也也应兼顾到方方法的经济和和简便。常用用的有甘油冷冷冻管保藏法法、斜面低温温保藏法等，此此类方法简单单易行。甘油冷冻管保藏藏法 将待待保藏菌接种种平板或琼脂脂斜面，适宜宜温度下培养养适宜时间后后(细菌2448小小时的培养物物，白色念珠珠菌72小时时的培养物)，用无菌接接

16、种环轻轻刮刮取菌苔，并并通过接种环环与试管壁之之间的轻轻摩摩擦使细菌充充分扩散到预预先装于试管管中的无菌蒸蒸馏水中，调调整菌液浓度度，向已制备备好的菌悬液液中加入等体体积、浓度为为20的无无菌甘油，轻轻轻振摇小管管，使内容物物充分混和，分分装于无菌小小管，制好的的甘油冷冻管管最好在-330贮存。斜面低温保藏法法 将工作作用菌种的典典型菌落接种种在适宜的固固体斜面培养养基，按规定定的温度和时间培养，待待菌生长充分分以后，把培培养好的新鲜鲜菌种管用牛牛皮纸包好，转转移至4左右冰箱保保存，如菌种种保藏管的塞塞子是橡胶塞塞，并采用半半固体高层培培养基穿刺培培养，则可以以保存时间较较长。铜绿假假单胞菌不

17、宜宜用本法保存存。3.1 菌种种(1)金黄色葡葡萄球菌(SStaphyylococccu aureuus)CMMCC(B)260033(2)枯草芽孢孢杆菌(Baacilluus subtiilis)CMCC(B)635501(3)大肠埃希希菌(Escchericchia coli)CMCCC(B)444102(4)铜绿假单单胞菌(Psseudommonas aerugginosaa)CMCCC(B)110104(5)生孢梭菌菌(Closstridiium sporoogeness)CMCCC(B)664941(6)白色念珠珠菌(Canndida albiccans)CMCC(F)980001(

18、7)黑曲霉(Asperrgilluus nigerr)CMCCC(F)9980033.2 菌液液制备制备的菌液，一一般当日使用用。取金黄色葡萄球球菌、枯草芽芽孢杆菌、大大肠埃希菌、铜铜绿假单胞菌菌的新鲜培养养物少许接种种至营养肉汤培养养基中，生孢孢梭菌的新鲜鲜培养物少许许接种至硫乙乙醇酸盐流体体培养基中，332.52.5培养1824小时；白色念珠菌菌的新鲜培养养物接种至改改良马丁培养养基或改良马马丁琼脂培养养基中，255.52.5培养2448小时，上上述培养物用用0.9无菌菌氯化钠溶液液制成每毫升升含菌小于1100菌落形形成单位(ccfu)的菌菌悬液。将黑曲霉菌斜面面的新鲜培养养物接种至改改良

19、马丁琼脂脂斜面培养基基上，25.52.5培养57天，使大大量的孢子成成熟。加入335ml 0.9无菌氯氯化钠溶液，用用玻棒或白金金饵轻轻振摇摇将孢子洗脱脱。然后，用用管口带有能能过滤菌丝的的装置(如薄薄层无菌棉花花或纱布的无无菌毛细吸管管)的吸管吸吸出胞子悬液液至无菌试管管内，用0.9无菌氯氯化钠溶液将将其稀释至每每毫升含小于于100cffu的孢子悬悬液(可采用用比浊法)。以上菌液在供试试验的同时，金金黄色葡萄球球菌、铜绿假假单胞菌、大大肠埃希菌、枯枯草芽孢杆菌用营养琼脂，白白色念球菌和和黑曲霉用改改良马丁培养养基注皿(11m1)或平平板涂布(00.1m1)，按按规定条件培培养后，计数数。4

20、培养基4.1 一般采采用商品脱水水培养基，临临用时按照使使用说明书进进行配制，配配制培养基时时称量要迅速以免吸潮而而影响称量的的准确性，同同时为避免增增加培养基中中的金属离子子及其他微量量化学元素而影响微生物物的生长、鉴鉴别、所用器器具应为洁净净玻璃器皿，所所用溶解用水水为纯水。4.2 培养养基的pH值值应符合规定定，否则必须须校正。调节节pH值：测测定pH值的的标准温度为为252，调调节pH值可可用无菌的llmolLL(1N)氢氢氧化钠或110碳酸钠钠溶液、lmmolL盐盐酸溶液或115%冰醋酸酸溶液。分装装好的培养基基及时密封后后必须在配制制当天(2小小时内最佳)进行灭菌处处理。 4.33

21、 新鲜配配制的培养基基，应按中国国药典规定的的处方，对培培养基的原材材料要进行挑挑选，化学药药品均需用CCP试剂规格格。4.3.1 除除葡萄糖和指指示液外，将将处方中各成成分加水后置置有石棉网的的电炉、可调调电磁炉或其它适宜的加热热设备中，微微温溶解。用用lmol/L氢氧化钠钠溶液调节ppH，使其比比规定的pHH值略高0.40.6，煮沸沸，用棉(纸纸)浆减压抽抽滤或以脱脂脂棉，滤纸等等滤材过滤，使使培养基澄清清。4.3.2 加入葡萄糖糖和指示液，摇摇匀，补足水水量，调节ppH值(比规规定的pH值值略高0.20.4)，使灭灭菌后为7.10.2，分分装，装量不不宜超过容器器的23，以以免灭菌时溢溢

22、出。4.3.3 硫乙醇酸盐盐流体培养基基I，分装至至适宜的容器器中，其装量量与容器高度度的比例应符合培养结束后后培养基的氧氧化层(粉红红色)不超过过培养基深度度的12，灭灭菌。在供试试品接种前，培培养基氧化层层的颜色不得得超过培养基基深度的l5，否则，须须经100水浴或流通通蒸汽加热至至粉红色消失失(不超过220分钟)，迅迅速冷却。培培养基只限加加热一次，并并防止被污染染。 4.33.4 灭菌菌应采用验证证合格的灭菌菌程序进行。培培养基应只能能进行一次蒸蒸汽灭菌处理理。固体培养基使用用前的融化，不不宜使用蒸汽汽灭菌柜融化化琼脂培养基基，宜选用沸沸水浴融化培培养基。 4.44 未开封封脱水培养基

23、基应避光储存存于25以下阴凉干干燥处，已开开封的脱水培培养基应盖紧，避光储存于于25以下阴凉干干燥处。制备备好的培养基基应保存在2225避光的环境境，有条件置置冰箱48冷藏储存较较好。培养基基若保存于非非密闭容器中中，应在三周周内使用；若若保存于密闭闭容器中，可可在一年内使使用。 4.55 培养基基的装量对于采用直接接接种法检查的的液体样品，培培养基的装量量与供试品的的装量相关，供供试品的装量小于于20ml的的样品，培养养基装量155ml；供试试品的装量大大于或等于220ml小于50mml的样品，培培养基装量440ml；供试品的的装量大于或或等于50mml小于1000ml的样品，培培养基装量8

24、80ml；4.5.2 对于采用直直接接种法检检查的固体样样品(含药品品及外科用辅辅料棉花及纱纱布)，培养养基的装量均为1100ml；对于缝合线线、一次性医医用材料及医医疗器具，如如果医疗器具具体积过大，培培养基的装量量可在20000ml以上，以将将其完全浸没没为准。4.5.3 对于采用薄薄膜过滤法检检查的样品，若若用封闭式薄薄膜滤器操作作的，培养基基装量100ml；若若用开放式薄薄膜滤器操作作的，培养基基装量50mml。 4.66 培养基基的适用性检检查培养基的检查包包括无菌检查查和灵敏度检检查；符合规规定者方可用用于供试品的的无菌检查。培养基的无菌检检查可在供试试品的无菌检检查前或与供供试品

25、的无菌菌检查同时进进行，但是所所用培养基不符合无无菌要求，供供试品的无菌菌检查结果应应视为无效。培养基的灵敏度度检查应对购购进的每个批批号的脱水培培养基进行灵灵敏度检查，检检查合格后方方可使用，但当培培养基的配制制方法和灭菌菌程序发生变变更时，应再再次对培养基基的灵敏度进进行检查。4.6.1 培养基无菌菌检查的操作作及结果判定定每批培养基随机机取不少于55支(瓶)，按按规定温度培培养14天，应应无菌生长。4.6.2 培养基灵敏敏度检查的操操作及结果判判定取每管装量为112ml的硫硫乙醇酸盐流流体培养基99支，分别接接种金黄色葡葡萄球菌、铜铜绿假单胞菌、枯草芽芽孢杆菌、生生孢梭菌各22支，每支接

26、接种菌量为llml(含菌菌小于1000cfu)，另另1支不接种种作为空白对对照，培养33天；取每管管装量为9mml的改良马马丁培养基55支，分别接接种白色念珠珠菌、黑曲霉霉各2支，每每支接种菌量量为lml(含菌小于1100cfuu)，另1支支不接种作为为空白对照，培培养5天，逐逐日观察结果果。空白对照照管应无菌生生长，若加菌菌的培养基管管均生长良好好，判该培养养基的灵敏度度检查符合规规定。对于配制后的选选择性培养基基的灵敏度检检查试验同上上。5 方法验证证试验为保证检验质量量，对所用的的检验方法必必须经过验证证，才能确保保检验结果的的准确可靠。当当建立药品的无菌菌检查法时，应应进行方法的的验证

27、，以确确认供试品在在该实验条件件下无抑菌活活性或其抑菌菌活性可以忽忽略不计。若若供试品的生生产工艺，原原、辅料组分分或检验条件件发生改变时时，检查方法法应进行重新新验证。针对药品的无菌菌检查试验，在在确定产品的的无菌检查试试验方法时或或建立新的检检查方法时，或当试验条件(包括培养条条件)发生变变更时，都必必须要对新的的或变更后的的检验方法加加以验证，以以确认供试品品在该实验条条件下无抑菌菌活性或其抑抑菌活性可以以忽略不计。确确保在实际检检验条件下，该该供试品的无无菌检查法的的准确性、有有效性和重现现性。验证时时，按“供试品的无无菌检查”的规定及下下列要求进行行操作试验。供供试品对每一一试验菌的

28、抑抑菌活性应逐逐一进行验证证。验证用菌种、菌菌液制备、各各试验菌所对对应的培养基基及培养温度度、参见3.1及3.2部分。5.1 薄膜膜过滤法验证证试验将规定量的供试试品按薄膜过过滤法过滤，冲冲洗，在最后后一次的冲洗洗液中加入试试验菌少于100CFU。取取出滤膜接种种至相应的培培养基中，或或将培养基直直接加至滤筒筒内。另取一一滤筒，不过过滤供试品，其其它操作同上上，作为阳性性对照，将含含培养基的容容器按规定温温度培养35天。各试试验菌及相应应的培养基逐逐一进行验证证。5.2 直接接接种法验证证试验取适宜装量的硫硫乙醇酸盐流流体培养基88管，分别加加入金黄色葡葡萄球菌、枯枯草芽孢杆菌菌、铜绿假单胞

29、菌、生生孢梭菌的菌菌液各两管；取适宜装量量的改良马丁丁培养基4管管，分别加入入白色念珠菌菌、黑曲霉菌菌菌液各两管管。每管加菌菌量小于1000cfu。其其中1管接入入规定量的供供试品，另11管作为阳性性对照，各试试验管按相应应规定的温度度培养355天。5.3 判断断与阳性对照比较较，如含供试试品各容器中中的试验菌均均生长良好，并并且与阳性对对照容器内的的培养结果相似，则则供试品的该该检验量在该该检验条件下下无抑菌作用用或抑菌作用用消除，供试试品可按该法法进行无菌检检查。若含供供试品的任一一容器中微生生物生长微弱弱、缓慢或不不生长，则供供试品的该检检验量在该检检验条件下有有抑菌作用，若若采用的是直

30、直接接种法，可可根据实际情情况增加培养养基的用量、在在冲洗液中或或培养基中使使用中和剂(如-内酰胺酶酶、对氨基苯苯甲酸、聚山山梨脂80)、或改为薄薄膜过滤法。若若采用的是薄薄膜过滤法，可可采用增加冲冲洗液的用量量、改变冲洗洗液的种类、更更换滤膜品种种等方法消除除供试品的抑抑菌作用。并并重新进行验验证试验。 已进行行过无菌检查查法方法验证证试验的供试试品，按此法法进行无菌检检查。 6 供供试品的无菌菌检查 6.11 检验数数量及检验量量检验数量是指一一次试验所用用供试品最小小包装的数量量。除另有规规定外，出厂厂产品应尽量量抽取批生产产开始和结束束或生产过程程出现异常情情况下的产品品进行检验；一般

31、情况下下，供试品无无菌检查若采采用薄膜过滤滤，应增加11/2的最小小检验数量作作阳性对照用用；若采用直直接接种法，应应增加供试品品1支(或瓶瓶)作阳性对对照用。检验量是指一次次试验所用的的供试品总量量(g或ml)。采用直接接接种法时，若若每支(瓶)供试品的装装量按规定足足够接种两份份培养基，则则应分别接种种硫乙醇酸盐盐流体培养基基和改良马丁丁培养基。采采用薄膜过滤滤法时，检验验量应不少于于直接接种法法的总接种量量，只要供试试品特性允许许，应将所有有容器内的全全部内容物过过滤。 6.22 培养基用用量 除另另有规定外，供供试品无菌检检查时，每支支培养基的实实际装量及所所占容器高度度的比例应与与“

32、验证试验”所用的培养养基相同。 6.33 阳性对对照 供试品品无菌检查应应进行阳性对对照试验。阳阳性对照菌的的选择原则：应根据验证证试验结果选选择相应对照照菌，阳性对对照管的加菌菌量为小于1100个cfu。阳性对对照管培养44872小时，应应生长良好。 6.44 阴性对照照 凡无菌菌检查，均应应取相应溶剂剂和稀释剂同同法操作作为为阴性对照。阴阴性对照不得得有菌生长。 6.55无菌检查操操作 无菌检检查法包括薄薄膜过滤法和和直接接种法法。只要供试试品性状允许许，应采用薄薄膜过滤法。 6.55.1 供试试品在移入缓缓冲间前应除除去外包装、消消毒外表面并并编号，培养养基管(瓶)用0.1%新洁尔灭或酒

33、酒精棉擦拭瓶瓶(管)外壁壁，然后连同同其他用具(包括无菌衣衣、帽、口罩罩等)移入缓缓冲间，开启启操作间紫外外灯和空气过过滤装置并使使其工作1小小时以上。 6.55.2 操作作人员用肥皂皂、水清洗双双手，关闭紫紫外光灯，进进入缓冲间，换换拖鞋，再用用75乙醇醇棉球擦手，穿穿戴衣、帽、口口罩、手套。将将所需物品剥剥去牛皮纸，移移入无菌间，每每次试验中所所用物品必须须计划好，并并有备用物。 6.55.3 供试试品外部消毒毒 6.55.3.1 将消消毒过的粉针针剂、油剂等等铝盖压封的的橡皮塞小瓶瓶，先用755乙醇或碘碘伏棉球擦拭拭外壁及瓶塞塞，待干，用用灭菌镊子剔剔去铝盖上的的铝质小圆片片，过火焰数数

34、次。将消毒过的安瓿瓿针剂先用碘碘酒棉球或碘碘伏棉球将安安瓿外部擦拭拭灭菌，待干干，用砂轮或灭菌锉轻轻割安瓿颈部部（便于折开开安瓿），再再用75%乙乙醇棉球将磺磺酒擦净，待待干。 6.55.3.3 其他供试品品容器表面或或外包装，可可参照上述用用适当消毒液液擦拭或浸没没后以无菌的的方式取内容容物。 6.55.4 供试试品制备用灭菌镊取出注注射器，在火火焰旁将针芯芯插入针管并并安上针头，供供试品瓶盖和和注射器针头头均应迅速通通过火焰数次次；当供试品品为粉针剂，瓶瓶盖为橡胶塞塞时，用注射射器吸取规定定的溶剂，在在已消毒好的的橡胶塞中心心位置刺入小小瓶加入溶剂剂，溶解，混混匀后吸出溶溶液，或选用用其它

35、适宜的的方法。如为为注射液、供供角膜创伤及及手术用的滴滴眼剂或灭菌菌溶液可直接接用注射器吸吸取药液，或或选用其它适适宜的方法。按按规定或需灭灭活的供试品品可用灭活剂剂溶解，将瓶瓶内供试液抽抽出稀释至规规定的浓度。需需加入空气加加压后便于抽抽出的供试品品，应用注射射器对着火焰焰抽取空气加加入，抽取瓶瓶中液体时，应应将供试品倒倒置并使针头头在液面下。供供试品如为直直接分装成注注射用无菌粉粉末的原料药药（大包装粉粉针剂），取取样时为缩短短暴露时间，应应由两人操作作。将放置于于缓冲间的包包装瓶用0.1%新洁尔尔灭抹净外壁壁，且经紫外外线照射1小小时后移入操操作间（台），除除去铝盖，用用75%乙醇醇棉或

36、碘伏棉棉球擦拭瓶口口橡胶塞外壁壁和瓶口缝隙隙，待干，戴戴好医用消毒毒手套，在火火焰旁小心揭揭开瓶塞，用用专用取样器器取出规定量量的样品，置置灭菌试管中中，密塞待用用，立即盖好好大包装瓶塞塞，用橡皮胶胶布及时封口，再再用封箱纸包包扎瓶口。如如果容器内有有一定的真空空，可用适当当的无菌器材材（如一端带带有除菌过滤滤器的针头），向向供试品容器器内导入无菌菌空气，再按按无菌操作开开启容器取出出内容物。供试品处理时所所用的溶剂、乳乳化剂、分散散剂、中和剂剂及其用量应应验证是有效的，并并对微生物生生长无影响。除另有规定外，供供试品处理及及接种，按下下列方法进行行。6.5.5 薄薄膜过滤法无菌检查用的滤滤膜

37、孔径为不不大于0.445m，直径约为为50mm。应应根据供试品品及其溶剂的的特性选择滤滤膜材质，如如抑菌性供试试品采用低吸吸附性的滤膜膜，油性供试试品选用疏水水性滤膜。水水溶性供试液液过滤前先将将少量的冲洗洗液过滤以润润湿滤膜。油油类供试品，其其滤膜和过滤滤器在使用前前应充分干燥燥。使用时，应应保证滤膜在在过滤前后的的完整性。同同时每片滤膜膜的总过滤量量不宜太大，以以避免滤膜上上的微生物受受损伤。薄膜过滤法采用用封闭式薄膜膜过滤器或开开放式薄膜过过滤器，可优优先选用封闭闭式薄膜过滤滤器。如采用用封闭式过滤滤器时，将一一次性集菌培培养器（依供供试品种类不不同选择适宜宜的集菌培养养器如抗生素素类采

38、用抗生生素专用集菌菌培养器）放放于电控集菌菌仪的排液槽槽上，培养器器的塑胶软导导管放于电控控集菌仪的蠕蠕动泵的管槽槽内，其进液液导管的双芯芯针头，插入入供试液或冲冲洗液等容器器的塞上。6.5.5.11 操作打开待检样品的的铝盖，复溶溶。吸取适量量药液加入00.9%无菌菌氯化钠溶液液或其他适宜宜的溶液至具具塞的瓶中，混混匀。如采用用封闭式过滤滤器，取出培培养器先检查查包装是否完完好无损，将将培养器逐个个插放在不锈锈钢座上，将培培养器的弹性性软管装入集集菌仪泵头，注注意定位准确确，软管走势势顺畅。将培培养器导管上上的针头插至至供试液容器器塞上，开动动电控集菌仪仪电源，将样样品瓶倒置固固定于支架上上，使药液均均匀通过集菌菌培养器，待待药液排尽，关关闭电源，将将针头取下，插插至装有适宜宜冲洗液的瓶瓶塞内，冲洗洗集菌培养器器的滤膜，照照上述操作要要求，冲洗次次数及冲洗量量与验证试验验保持一致。滤滤干，关闭电电源。将集菌菌培养器的排排气孔上胶帽帽取下，集菌菌培养器底部部的排液管口口拧上，将冲冲洗瓶取下换换上相应的培培养基瓶，启启动电源，将将培养基泵入入指定的培养养器内，关闭闭电源。用小小夹夹闭与培培养器连接部部的软管，