高效液相色谱与化学发光分析联用检测葛根素

1、高效液相色谱与化学发光分析联用检测葛根素【摘要】目的研究高效、灵敏、快速的检测葛根素的新方法。方法高效液相色谱与化学发光分析联用。结果方法的线性范围为1.8180gL-1；相关系数为0.9995；检出限为0.8gL-1；相对标准偏向为2.89%n=11。结论此法操作简单，实验时间短，灵敏度高，用于实际样品分析，检测结果准确。【关键词】高效液相色谱；化学发光检测；葛根素葛根为豆科植物野葛的枯燥根，是卫生部公布的“既是食品,又是药品的药用植物之一1。葛根常用于高血压并冠心并心绞痛等疾病的治疗，在机体抗氧化、降低血粘度、防治老年痴呆症、抗癌、治疗酒精依赖等方面也有显著作用2，葛根素是葛根的主要药理活

2、性有效成分，为一种异黄酮化合物，其分子构造见图13。葛根素的检测对控制葛根及复方葛根合剂的产品质量具有非常重要的意义。目前,对葛根素的测定方法主要有紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高速逆流色谱法和毛细管电泳-电化学检测法等4，尚未见高效液相色谱与化学发光分析联用检测葛根素的报道。化学发光分析因为具有灵敏度极高、仪器设备简单、线性范围宽和分析速度快等突出优点而备受关注5。化学发光检测技术与高效液相色谱相结合,能克制化学发光选择性差的弱点,因此使得HPL-L成为一种有效的痕量及超痕量分析技术6。研究发现,葛根素对Luinl-K3Fe(N)6化学发光体系具有很强的增敏效果，在一定浓度范围

3、内，葛根素浓度与相对发光强度呈线性关系,在18反相键合相为色谱柱,KH2P4-H3H-H2为流动相的条件下,基线稳定,脉动小,且使葛根素能到达基线别离。基于此,建立起葛根素的HPL-L分析新方法。方法的线性范围为1.8180gL-1；相关系数为0.9995;检出限为0.8gL-1;相对标准偏向为2.89%(n11);样品检测结果与UV检测结果相吻合。本法操作简单,实验时间短,灵敏度高,检出限比已报道的高效液相色谱与紫外分光光度检测联用检测葛根素要低23个数量级71仪器与材料L-6A型高效液相色谱仪(Shiadzu,日本);BPL微弱发光测量仪中国科学院生物物理研究所;HL-2恒流泵浙江温州市龙

4、方仪器配件厂;超声波清洗器;18色谱柱(id5.0300,大连伯瑞色谱中心);鲁米诺储藏液:0.01lL1,称取0.8860g鲁米诺Fluka公司,参加17.5l浓度为1.0lL1的NaH溶液,溶解，定容至500l,置于4冰箱保存;标准品葛根素储藏液:0.40gL1,称取标准品葛根素(中国药品生物制品检定所)0.0200g,乙醇溶解,定容至50l,于棕色试剂瓶保存;K3Fe(N)6储藏液:1.010-3lL-1。其余试剂均为分析纯,实验用均为去离子二次蒸馏水。2方法按图2装置操作,流动相使用前经0.45滤膜抽滤脱气,待基线稳定后,取标准品葛根素溶液和样品溶液20l进样(高效液相色谱仪自带20l

5、采样环),记录仪记录化学反响的发光信号,以相对峰高定量。转贴于论文联盟.ll.3结果3.1色谱条件的选择3.1.1流动相的选择对一系列H3H-H2、KH2P4-H3H-H2、H3H-H3H-H3Na作为流动相的条件进展了优化,发现KH2P4(0.25lL-1)-H3H-H2(101575,V/V/V)作为流动相别离效果最好,故以此作为流动相。3.1.2葛根素的色谱行为当高压输液泵泵速为1.0l/in,KH2P4(0.25lL-1)-H3H-H2(101575,V/V/V)作为流动相时,浓度为10gL-1的标准品葛根素和样品葛根素色谱图如图3所示,保存时间为6in,从图3可知葛根素别离效果好。3

6、.2发光条件的选择3.2.1鲁米诺的NaH浓度的选择鲁米诺与K3Fe(N)6的化学发光反响要在pH=12的碱性介质中进展，而流动相KH2P4-H3H-H2为酸性，因此必须增大鲁米诺溶液的NaH浓度。逐渐增大鲁米诺溶液的NaH浓度，同步检测混合液的pH值,当鲁米诺溶液的NaH浓度到达0.02lL-1时，混合液的pH值刚好到达12，其pH也不宜过大，如pH过大，进样和洗脱时检测盘管的pH波动大，空白值随pH值波动也大，误差也随之增大，故鲁米诺的NaH的浓度选择0.02lL-1。3.2.2鲁米诺浓度的选择Luinl作为化学发光试剂,其浓度上下直接影响化学发光强度。实验中研究了其浓度对化学发光信号的影

7、响(见图4),发现发光强度随着Luinl浓度的增加而增大,但其浓度超过1.010-4lL-1时,发光强度随着Luinl浓度的增加而减小,因为Luinl自吸作用。因此,在本实验选择Luinl浓度为1.010-4lL-1。3.2.3铁氰化钾浓度的选择K3Fe(N)6作为氧化剂,其浓度的大小对化学发光强度的影响至关重要。实验发现(见图5),发光强度随K3Fe(N)6浓度的增加而增大,但当K3Fe(N)6的浓度超过1.010-5lL-1时,发光强度随着K3Fe(N)6浓度的增加而减小,原因是K3Fe(N)6本身对光有吸收。因此,本实验选择K3Fe(N)6的浓度为110-5lL-1。3.3校准曲线、相对

8、标准偏向和检出限在上述选定的实验条件下,葛根素的浓度在1.8180gL-1范围内与相对发光强度呈良好的线性关系,其线性回归方程为Y=37.34+20.73X(X:gL-1);r=0.9995;对10gL-1的葛根素平行测定11次,其相对标准偏向为2.89%;根据IUPA建议计算本方法的检出限为0.8gL-1。3.4样品分析将市售野葛根枯燥后研细，称取2.00g粗粉置于索氏提取器中，用200l甲醇回流提取5h，提取液经0.45滤膜过滤，得样品溶液。用50l进样器进样20l进展别离测定，重复测定5次，取均值，并与UV=254n检测对照，结果见表1，二者相吻合。表1葛根中葛根素含量测定结果略4结论综

9、上所述,本文旨在建立高效液相色谱与化学发光分析联用检测葛根素的新方法。实验证明,本法操作简单,实验时间短,灵敏度高,检出限比已报道的高效液相色谱与紫外分光光度检测联用检测葛根素要低23个数量级7。本法用于实际样品分析,检测结果与高效液相色谱与紫外分光光度检测联用检测结果相吻合。【参考文献】1国家药典委员会.中国药典，部S.北京：化学工业出版社,2000：273.2王臻,张丽,王炎.葛根研究进展J.上海医药,2022,28(10):464.3刘爱茹,张秀琴.葛根中总黄酮的导数脉冲极谱法测定J.药学学报,1987,22(3):208.4李梅青,盛旋.反相高效液相色谱法用于葛根黄酮提取物的别离与主要活性成分的测定J.分析化学，2022,312：178.5胡双修，周光明，杨光明.低压离子色谱-化学发光联用在线检测痕量钙J.西南师范大学学报自然科学版，2022