黄曲霉毒素检测

1、黄曲霉毒素检测第1页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五 黄曲霉毒素(aflatoxin，简称为AF)是到目前为止发现的毒性最大的真菌毒素。 它可通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全，对人体及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重，该毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中。黄曲霉毒素十分耐热，加热至230才能被完全破坏，因此一般烹饪加工也不易消除。黄曲霉毒素介绍第2页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五黄曲霉毒素分布范围广 黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果（特别是花生和核桃中）中。日

2、常检验发现在大豆、谷物、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素（其中以花生和玉米污染最严重）。第3页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五毒性极强 黄曲霉毒素进入人体后主要经消化道吸收，大部分分布 在肝脏、肾脏。因此主要引发肝癌、胃癌等，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。黄曲霉毒素如不连续摄入，一般不在体内积蓄。一次摄入后约1周将大部分排出。只有严重霉变的粮食才可能会含有大量毒素，导致急性毒性。第4页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五耐热性强 在一般的烹调加工温度下，黄曲霉毒素被破坏的很少；即使是 200高温加热

3、，也不能完全正确破坏。一般黄曲霉毒素的裂解温度为280，黄曲霉毒素 B1 的裂解温度为 268。第5页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五 黄曲霉毒素的种类 迄今为止发现的黄曲霉毒素主要有4种：即B1、B2、C1、G2，其中B1被认为是主要的有毒物质，有2种这些毒素的代谢产物M1和M2。 其中黄曲霉毒素B1主要存在于农产品，动物饲料，中药等产品中；黄曲霉毒素M1是动物摄入黄曲霉毒素B1后在体内经羟基化代谢的产物，一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的可食部分，如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中，其中以乳最为常见。 黄曲霉毒素M1的毒性和致癌性与黄曲霉毒素B1的基本相似。由于牛乳

4、及其制品是人类、特别是婴儿的主要食品，所以其危害性更大。 第6页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五中国食品中黄曲霉毒素的限量标准标准食品种类最大限量GB2761-81玉米、花生仁、花生油20g/kg大米、其他食用油10g/kg其他粮食豆类、发酵食品5g/kg婴儿代乳食品不得检出GB9676-88牛乳及其制品0.5g/kg第7页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五免疫分析法仪器分析法化学分析法生物鉴定法检测方法第8页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五黄曲霉毒素的检测方法目前，测定食品中的黄曲霉毒素的方法有：薄层层析法、液相色谱法、放射免疫

5、分析法、酶联免疫法、亲和层析法、微柱筛选法、金标试纸法等。这些方法或多或少都具有如下不足之处：（1）、在操作过程中，需要使用剧毒的黄曲霉毒素M1作为标定标准物，对操作人员造成巨大的沾污危险，而且黄曲霉毒素M1标准物质购买十分困难。（2）、操作过程烦琐、复杂、时间长，劳动强度大。（3）、仪器设备昂贵、笨重、操作复杂，难以实现现场快速分析。（4）、灵敏度较差，重复性很难得到满意结果。第9页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五薄层色谱法（TLC）其原理是:样品经提取、浓缩、薄层分离后,在365 nm波长的紫外光照射下,黄曲霉毒素B1、B2产生紫色荧光,G1、G2产生绿色荧光,然后根

6、据其在薄层板上显示的荧光的最低检出量来定量。优点是:所用的试剂、设备简单,费用低廉,容易掌握,适用大量样品的分离、筛选,一般的实验室均可开展,属于定性和半定量的功能。第10页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五高效液相色谱法(HPLC) 以C18柱为固定相,以水+异丙醇+乙腈(80 +12+8)为流动相,用荧光检测器进行检测,其激发波长365 nm,发射波长450 nm,以保留时间定性，峰面积定量，这些基本参数大致相同，但在流动相的选用上却差异较大。样品用甲醇和水混合液进行萃取,随后进行衍生化处理,处理后溶解于流动相,进行液相色谱测定。 第11页，共19页，2022年，5月2

7、0日，1点44分，星期五酶联免疫吸附法(ELISA)是抗原(抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(抗原)与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫学反应，用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大致采用两种方式检测黄曲霉毒素，一种是用双抗体夹心法，另一种是用竞争法。第12页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五微柱法 测定黄曲霉毒素，是利用微柱管内的硅镁型吸附剂吸附黄曲霉毒素并在365nm紫外光下显示荧光，其强度与一定浓度的黄曲霉毒素含量成正比关系，由此可简略定量黄曲霉毒素。第13页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五金标试纸法 金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免

8、疫分析法,可一步式检测AFT。一步式AFT快速检测纸法可在510 min完成对样品中AFB1的定性测定,具有简单、快速、灵敏度高等特点,无须仪器设备配合测定,检测既可在实验室中进行,也可在农场、饲料混合车间等进行实地测定,对黄曲霉毒素定性检测准确度在85 %以上,灵敏度为4 ng/mL ,可测出样品中20 ng/g的黄曲霉毒素10。Sun Xiu lan等合成一种对AFB1具有特异性的抗体金标探针,该纳米金标探针用于免疫色谱法对AFB1分析,完成一个样品分析所需要的时间少于10 min,比ELISA少610 min,在标准品的对照下,最低检测限可达2.5ng/mL第14页，共19页，2022年

9、，5月20日，1点44分，星期五生物鉴定法 利用 AFT 能影响微生物、水生动物及家禽等生物体的细胞代谢, 来鉴定 AFT 的存在, 其特点是待检样品不需很纯, 主要用于定性鉴定, 包括: 抑菌试验; 对微生物遗传因子影响试验; 细菌发光试验; 荧光反应; 组织培养检测法; 鸡胚试验; 鸭胚试验; 鳟鱼试验; 植物试验; 饲喂实验动物试验。这些方法专一性差, 灵敏度低, 一般只作为化学分析法的佐证。第15页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五衍生方法 可分为柱前衍生法和柱后衍生法。对黄曲霉毒素衍生的目的主要是为了增加测定时的荧光强度，柱前衍生法主要有三氟乙酸和稀盐酸法，柱后衍

10、生法主要有溴法和碘法。柱后衍生需增加泵、校后反应器和控温箱等装量。在实践中以柱前衍生较多，因柱前衍生法容易推广，且大多采用三氟乙酸衍生，并在衍生前后分别用氮气或直接吹气挥干。第16页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五最新国标方法“免疫亲和柱法”较好的解决了上面的不足，该种方法可以采用配套的荧光仪进行检测，也可以和高效液相色谱法结合，解决标准物污染和操作过程繁复等问题。同时该种方法有着较好的权威性和通用性，且为国外多个组织认可，被列为标准方法，如：美国公职分析化学家协会（AOAC）美国农业部联邦谷物检测中心（FGIS）国际纯粹与应用化学协会（IUPAC）美国食品药品行政署（U

11、S-FDA）美国农业部（USDA）同时在国内被认证的机构：中国出入境检验检疫局（CIQ）、中华人民共和国国家标准（GB）第17页，共19页，2022年，5月20日，1点44分，星期五 为了开发一种简单、快速、灵敏、准确的分析方法,美国VICAM(维康)公司与哈佛大学、麻省理工学院、约翰霍普金斯大学、AOAC、FDA、FGIS、美国农业部等著名大学和政府机构通力合作，发明研制了一系列以单克隆免疫亲和柱为分离手段，用荧光计、紫外灯作为检测工具的分析方法。该项技术有一下特点： 1、认证机构广泛，通用性强2、分析速度快，一个样品只需1015分钟，其他传统的方法要做到定量分析需要几小时至几天的时间。3、灵敏度高，测定范围广泛（0300ppb）,用荧光计可以测定0.1ppb的黄曲霉毒素M1，用HPLC可以检测出10ppt的黄曲霉毒素M1。4、采用单克隆免疫技术，可以特效性地将黄曲霉毒素和其他真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高，正确性和可靠性强。5、仪器轻便容易携带，自动化程度高，操作简单，直接读出测试结果，对实验操作人员要求不高，可以在小型实验场所使用。6、不需要剧毒的黄曲霉毒素和其他真菌毒素标准物来标定，所以在整个实验过程中，绝对安全可靠。免疫亲和柱法(IAC-AFLATEST)第18页，共19