16抗生素类药物的分析

1、2021/9/131药物分析主讲: 罗容珍Pharmaceutical Analysis第十一章 抗生素类药物的分析22021/9/13Contents概 述1-内酰胺类2氨基糖苷类3四环素类4高分子杂质检查532021/9/13第一节 概述1.抗生素（antibiotics） 在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称2.分类 内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类) 氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、依替米星) 四环素类(四环素、金霉素、土霉素) 大环内酯类(红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素) 多烯大环类(制霉菌素、两性霉素B) 多肽类(多黏菌素、放线菌素)42021/

2、9/13第一节 概述3.来源 生物合成（发酵） 化学合成或半合成4.特点 化学纯度较低 活性组分易发生变异 稳定性差52021/9/13第一节 概述5.抗生素质量分析生物学法、物理化学法 鉴别：理化方法、微生物法 检查：水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等 含量/效价测定： 微生物法 ： 与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大 理化方法：准确度与专属性较高, 且操作简便；但与临床疗效有偏差62021/9/13第二节 内酰胺类 青霉素(苄青霉素) (penicillins)氨苄西林阿莫西林72021/9/13第二节 内酰胺类头孢氨苄头孢拉定头孢羟氨

3、苄头孢噻吩钠82021/9/13第二节 内酰胺类6-aminopenicillanic acid,简称6-APA青霉素类7-aminocephalosporanic acid,简称7-ACA头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻嗪环92021/9/13第二节 内酰胺类一、结构与性质1.酸性（羧基） pKa 2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。普鲁卡因青霉素102021/9/13第二节 内酰胺类2.手性C （旋光性）3.UV青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构260nm112021/9/134. 内酰胺环(四元环张力+酰胺键 ) 第二节 内酰胺类干燥条件较稳定，溶液不稳定

4、某些氧化剂、金属离子、温度122021/9/13第二节 内酰胺类二、Identification(一)色谱法HPLC (tR)TLC (Rf)(二)光谱法IR UVNMR132021/9/13第二节 内酰胺类142021/9/13第二节 内酰胺类152021/9/13第二节 内酰胺类头孢利定的NMR鉴别法(JP14)取本品50mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱时，应显示3.8 附近 6.97.5 7.99.0 单峰信号 多重峰信号 多重峰信号 2 ： 3 ： 5162021/9/13第二节 内酰胺类(三)呈色反应1）羟肟酸铁反应内酰胺环内酰胺类NH2OHHClNaOH羟肟酸 Fe3+ H

5、+显色（红、棕、褐）2）茚三酮反应-氨基 茚三酮 蓝紫色172021/9/13第二节 内酰胺类3）双缩脲反应内酰胺类 碱性酒石酸铜紫色182021/9/13第二节 内酰胺类4）变色酸-硫酸反应H2SO4 HCHO变色酸（缩合）显色5）重氮苯磺酸反应酚羟基（偶合）6）铜盐反应头孢氨苄的专属反应192021/9/137）硫酸-甲醛反应(BP)第二节 内酰胺类青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)焰色反应K+、Na+三、Purity Test(聚合物、有关物质、异构体等)1.聚合物头孢他啶中聚合物测定202021/9/13第二节 内酰胺类色谱条件与系统适用性试验 用葡聚糖凝胶G-10（40120m）为填充

6、剂，玻璃柱内径1.31.6cm，床体积5060ml；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠2.19g和磷酸二氢钠0.54g，加水100ml使溶解，调节pH至7.0），流动相B为水；流速为0.8ml/min；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液进样200l进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.751.5。两种流动相系统中蓝色葡聚糖的保留时间比应在0.931.07之间。对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200l，峰面积值的相对标准差应小于5.0%。对照品溶液的制备 取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成每

7、1ml中含头孢他啶100g的溶液，摇匀212021/9/13第二节 内酰胺类测定法 取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含头孢他啶20mg的溶液，立即进样200l，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200l注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3% 主成分自身对照法 面积归一化法 限量法 自身对照外标法222021/9/13 萄聚糖凝胶立体网状结构图原理“分子筛”第二节 内酰胺类232021/9/13第二节 内酰胺类2.有关物质与异构体头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 色谱条件与系统适用性试验：ODS

8、分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）为流动相，流速1ml/min；检测波长278 nm。要求头孢呋辛酯A，B异构体之间，头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯2-异构体之间的分离度应大于1.5；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500异构体 取本品适量，配制成每1ml中约含0.25mg的溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图。B异构体峰的相对保留时间约为0.85，A异构体峰的相对保留时间为1.0。242021/9/13第二节 内酰胺类40020600302010时间(min)峰高(mAU)65432113.95411.9192.401供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、

9、B异构体峰的面积和之比应为0.480.55。BA3-EE252021/9/13第二节 内酰胺类有关物质 取本品适量，精密称定，加流动相制成约含0.25mg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成2.5 g/ml的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，其中E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)，3-异构体峰面积不得大于1.5倍(1.5%)，其余单个杂质峰面积的和不

10、得大于3倍(3.0%)。(供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计)262021/9/133.UV第二节 内酰胺类4.有机溶剂5.结晶性第一法(偏光显微镜法)第二法(X射线粉末衍射法)四、Assay 碘量法 汞量法 酸碱滴定法 羟肟酸比色法 HPLC法272021/9/13第二节 内酰胺类阿莫西林克拉维酸钾片色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.40.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为0.7ml/min；检测波长

11、为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5 测定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。282021/9/13第二节 内酰胺类292021/9/13第三节 氨基糖苷类 氨基环醇+氨基糖苷链霉素(Streptomycin)3020

12、21/9/13第三节 氨基糖苷类巴龙霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脱氧链霉胺巴龙胺D核糖巴龙霉糖巴龙二糖胺312021/9/13第三节 氨基糖苷类庆大霉素(gentamycin)绛红糖胺(紫素胺)2-脱氧链霉胺加洛糖胺(N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺)322021/9/13第三节 氨基糖苷类一、结构与性质1）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐2）溶解度（氨基、羟基）：水溶性3）旋光性（糖）：多个手性碳4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解332021/9/13二、Identification第三节 氨基糖苷类坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄糖胺反应342021/9/13第三节 氨基糖

13、苷类1.茚三酮反应羟基胺类,-氨基酸2. Molisch 试验 五碳糖或六碳糖结构红紫色羟甲基糠醛(含六碳糖结构氨基糖苷类酸性水解产物)352021/9/13第三节 氨基糖苷类蓝紫色3. N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色362021/9/13第三节 氨基糖苷类乙酰丙酮OH-对二甲氨基苯甲醛H+372021/9/13第三节 氨基糖苷类4.麦芽酚反应链霉糖特有反应H+5.坂口反应链霉胍特有反应链霉素OH-水解8-羟基喹啉 NaOBr或-萘酚 链霉胍橙红色6.硫酸盐反应382021/9/137.色谱法8.光谱法第三节 氨基糖苷类三、

14、Purity Test1.链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查来源：发酵中产生方法：TLC中的对照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的检查(TLC)3.庆大霉素C组分的测定392021/9/13第三节 氨基糖苷类色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水冰醋酸甲醇(25:5:70) 配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液为流动相（必要时调节甲醇的含量）；检测波长为330nm 。理论板数按C2组分峰计算应不低于2000。C2a 峰和C2峰的分离 度应符合要求。 测定法 取本品适量，精密称定，加水制成每1ml 中含0.65mg的溶液，精密量取4.0 ml，置10ml量瓶中，加异丙

15、醇2ml与邻苯二醛试液1.6ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，置60水浴中加热15分钟，冷却，滤过，取续滤液10l 注入液相色谱仪，记录色谱图； 另取庆大霉素标准品，同法测定。C组分的保留时间依次为：C1、C1a、C2a、C2。量取C1、C1a、C2a、C2的峰面积。 C1应为2550，C1a应为1540，C2aC2应为2050 。 402021/9/13第三节 氨基糖苷类庆大霉素无紫外吸收，需进行衍生化处理后再进行HPLC测定。max = 330nm412021/9/13讨论第三节 氨基糖苷类1、柱效：以C2峰计算，理论板数应不低于2000，在此柱效下各组分之间才能达到规定的分离度。为此色谱柱

16、做适当选择。2、流动相：流动相极性适当控制(适当调节甲醇的比例)。 极性过强，出峰快，分离不佳。C1峰与衍生试剂等杂质峰难分析;极性过弱，出峰太慢。实验表明，C2峰的保留时间控制在20min30min较为适宜。3、衍生化试剂与衍生物的稳定性：配制后不能久置，时间久了试剂峰峰高增加并影响组分测定，一般避光保存可使用三天。生成的衍生物不稳定。4、离子对试剂浓度影响：离子对试剂浓度对庆大霉素OPA衍生物保留值有影响。422021/9/13第三节 氨基糖苷类 BP(2005)HPLC-ECD Ch.PHPLC-ELSD4.硫酸盐测定EDTA滴定四、Assay微生物检定法HPLC法432021/9/13

17、第四节 四环素类ABCD123456789101112442021/9/13一、结构与性质第四节 四环素类1）两性： -OH酸性 N(CH3)2碱性 Ca2+、Mg2+生成不溶性盐；Fe3+形成红色配合物； Al3+形成黄色配合物 ；pH3 7.5 多价阳离子与酚二酮荧光 与酸、碱均可成盐； 临床多用盐酸盐； 强酸或强碱中溶解度 2）旋光性3）UV和荧光 4）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基)452021/9/13弱酸性（pH2-6） A环C-4异构化 差向四环素酸性（pH 2） C环脱水 脱水四环素 碱性 C环开环，形成内酯 异四环素5）不稳定性第四节 四环素类A.差向异构化蓝色荧光淡黄黑46

18、2021/9/13第四节 四环素类AApH2.06.0（氢键，土霉素、多西环素不易差向异构化）472021/9/13第四节 四环素类B.酸性脱水降解max = 445nmmax = 435nmDDDCBBCBC482021/9/13C.碱性脱水降解第四节 四环素类OH-492021/9/13第四节 四环素类二、Identification1、HPLC2、TLC (正相分配薄层色谱)EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象3、IR4、UV5、显色法浓硫酸三氯化铁502021/9/13200nm300nm400nmTC第四节 四环素类三、Purity Test1.有关物质HPLC2.杂质吸光度UV268

19、nm355nm512021/9/13第五节、高分子杂质的检查生产过程贮存过程使用不当高分子杂质内源性(药物自身聚合物 )外源性(蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物 )发酵过程控制重点522021/9/13第五节、高分子杂质的检查1.基本结构青霉素族多肽（青霉素噻唑多肽）聚合物母核参于反应侧链参于反应头孢菌素族与母核有关的N型聚合反应侧链参与反应的L型聚合反应532021/9/13第五节、高分子杂质的检查2.特点（1）发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片均可带入产品中，相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子，形成青霉素噻唑多肽类杂质。（2）有不同聚合度和不同机理聚合反应形成的聚合物，聚合物发

20、生不同程度的降解作用。（3）以异构体存在样品，同聚和异聚反应可同时发生。（4）高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关（溶媒结晶、喷雾干燥）542021/9/13第五节、高分子杂质的检查3.杂质控制方法反相高效液相、离子交换色谱和凝胶色谱。葡聚糖凝胶SephadexC10自身对照外标法2021/9/1355Thank You !562021/9/13青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OH青霉素酶青霉酸H2OpH2100青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2572021/9/13582021/9/131. 熟悉抗生素类药物分析的特点及其 常规检验项目。了解抗

21、生素类药物 的分析现状，熟悉生物学法与物理 化学法测定效价的原理及优缺点。2. 掌握内酰胺类抗生素的结构、 性质、鉴别及含量测定。第十一章 复习内容592021/9/133. 掌握氨基糖苷类抗生素的结构、性 质及鉴别，了解其检查及含量测定4. 掌握四环素类抗生素的结构及性质，了解其鉴别、检查及含量测定5. 了解抗生素类药物的质量考察方法602021/9/1399：89下列哪个药物会发生羟肟酸 铁反应 A. 青霉素 B. 庆大霉素 C. 红霉素 D. 链霉素 E. 维生素C 612021/9/1399m：71中国药典(2005年版)测定头 孢菌素类药物的含量时，多 数采用的方法是 A. 微生物法 B. 碘量法 C. 汞量法 D. 正相高效液相色谱法 E. 反相高效液相色谱法622021/9/1395：139属于-内酰胺类