肝糖原的提取、鉴定与定量试验报告

1、南方雇科大学生物化学实验报告姓 名:学 号:专业年级:组另I:生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名 李某某批改日期 2013-06-03格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman ；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出 现多行、多页空白现象。一、实验目的1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与慈酮比色测定糖原含量的原理和注意事项， 掌握其操作方法。3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4、熟练运用溶液

2、混匀的各种方法。5、正确掌握溶液转移的操作。6、正确操作使用分光光度计。二、实验原理1、肝糖原的提取与鉴定糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋 白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使 用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将 滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中， 依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应 和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。CuSO4 十 2NaOH = Na2

3、SO4+Cu(OH)2 ；2Cu(OH)2 十 C6H12O6 = 2CuOH 十氧化型葡萄糖 +H2O2CuOH = Cu20；红色)+H2OCu(OH)2= CuO；(黑色)+H2O2、肝糖原定量测定糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物一5-羟甲基味喃甲醛，此化合物再与慈酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10100)g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法(直接比较法)即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先谿于浓碱

4、中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。三、材料与方法：以流程图示意1、材料：(1)样品：鸡肝(2)试剂：95%乙醇、5% (W/V)三氯乙酸、浓盐酸、12.5mol/L (50%) NaOH溶液、 碘试剂、班氏试剂、5.35mol/L (30%) KOH溶液、标准葡萄糖液(50mg/L)、慈酮显 色剂(3)仪器和器材：普通离心机、室温-100C恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天 平、剪刀、银子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管(2ml、 5ml)、1000仙l微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板2、方法：(1)肝糖原的提取与鉴定w加碘试剂2滴糖原溶液2

5、滴沉淀（弃去）上清液（取2ml）+2ml 95%乙醇，混匀，静置w加碘试剂2滴糖原溶液2滴沉淀（弃去）上清液（取2ml）+2ml 95%乙醇，混匀，静置10min离心 5min ( 4000r/min )上清液（弃去）沉淀沸水浴2min ,溶解沉淀白瓷板孔穴中糖原溶液1ml1 W +浓HCL5滴加碘试剂2滴 沸水浴15min,冷却_IW呈色对比+50%NaOH 5滴糖原水解液2滴糖原水解液+班氏试剂4滴混匀沸水浴2min,观察变化（2）肝糖原定量测定四、结果与讨论： 结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。1、结果：(1)实验现象：1)肝糖原的提取与鉴定第一次离心

6、后，肝匀浆分为2层，上层为上清液，不完全澄清，下层为淡褐色沉淀图1肝匀浆图2肝匀浆第一次离心后加入乙醇混匀并静置后，溶液分层，上层为上清液，下层有白色絮状沉淀。第二次离心后，溶液分为图1肝匀浆图2肝匀浆第一次离心后加入乙醇混匀并静置后，溶液分层，上层为上清液，下层有白色絮状沉淀。第二次离心后，溶液分为2层，上层为上清液，试管底部有少量白色沉淀加入蒸储水并沸水浴后，白色沉淀溶解。白瓷板上，糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，与碘自身的黄色有明显区别图4呈色对比结果（左为糖原溶液加碘试剂，右为碘试剂）往糖原水解液中加入班氏试剂后，溶液呈蓝色（班氏试剂本身为蓝色）。沸水浴后,溶液变为砖红色（生成砖红色沉淀）

7、。图5糖原水解液图6沸水浴前醇红色沉淀图5糖原水解液图6沸水浴前醇红色沉淀图7沸水浴后2）肝糖原定量测定往鸡肝中加入KOH并沸水浴后，溶液变为红棕色。图8沸水浴后，溶液变为红棕色水浴前，空白管呈黄色，标准管呈绿色，样品管呈黄色（颜色比空白管浅）。水浴后,空白管无明显变化，标准管颜色略变深，样品管由黄色变为深绿色（颜色比标准管深）（2）实验数据:图9水浴前图10水浴后测定次数标准管样品管10.5930.40120.5930.39730.5940.396平均值0.5930.398表1标准管和样品管测得的吸光度（A620）及平均值按下式计算样品中肝糖原的含量：肝糖原（g/100g 肝组织）= * 0

8、.05 * * * 1.11A标准肝组织重（g）1000由于样品稀释了一倍，因此计算结果需乘二。结果：肝糖原的含量为4.966g/100g肝组织。故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝组织，且肝糖原含量为4.966g/100g肝组织。2、讨论：（1）实验数据分析：本次实验测得肝糖原含量为4.966g/100g肝组织。查书得饱食鸡肝肝糖原含量为23g/100g肝组织。本次实验结果偏大，说明肝组织中含有过多肝糖原，试验所用鸡肝为脂肪肝。(2)呈色对比结果分析：糖原溶液与碘试剂反应呈红棕色，与碘试剂本身的黄色区别 明显，说明糖原含量较大。(3)糖原水解液与班氏试剂反应结果分析：该反应主要是通过检测葡萄糖与班氏试剂 的还原性糖反应间接鉴定溶液中糖原的存在。糖原溶液被浓盐酸水解为葡萄糖，葡萄糖 中的醛基可被Cu(OH)2氧化为竣基，即把葡萄糖氧化为葡萄糖酸，Cu2+则被还原生成CU2O砖红色沉淀。因此水浴后，溶液由蓝色变为砖红色，实验现象明显。(4)注意事项：1)慈酮试剂为浓硫酸所配制，使用时应小心谨慎。若不慎沾到皮肤上，应立即用大量 清水冲洗。2)离心后，用移液枪吸取上清液时应避免枪头触及沉淀，否则会使沉淀物上浮，导致 上清液浑浊。避免将枪头伸到液面下再按按钮，否则枪头喷出的气泡也会激起沉淀物。3)打开室温-100C恒温水浴箱盖子时要小心水蒸气，以免烫伤。4)使用离心机时要注意配