现代测试技术原理和应用

1、分子荧光光谱定性分析依据荧光光谱是激发态分子从第一激发态的最低振动能级跃迁回到基态中各个不 同能级时，通过发射光子方式释放能量，其能量的大小和第一激发态能级和基态各能级差有 关；荧光光谱谱线的形状取决于分子基态中能级分布情况。因此不同分子的荧光谱图不同。 定量分析依据（激发波长一定的条件下）荧光强度（F）和溶液中吸收光的强度（Ia）及荧 光物质的荧光效率（中）成正比：F=9 Ia在极稀溶液（8lc 0.05）时，荧光强度（F）和溶液中荧光物质的浓度（c）成正比：F=kc 应用有机物质的定性和定量测定；生物分子的检测；生物大分子催化、折叠等动力学过程DNA分析； DNA含量分析；DNA碱基序列分

2、析；在体基因检测；毛细管电泳柱后的高效检测器一激光诱导荧光检测荧光：第一激发单重态的最低振动能级f基态；磷光：第一激发三重态的最低振动能级f基态；2.分子磷光光谱发光机理分子吸收激发光源的光能后，被激发至激发态，由于在激发过程中分子中的电子 自旋发生变化，从基态单重态激发至激发态的三重态，或从基态一单重态激发至激发态一 单重态，然后通过体系间跨越跃迁到三重态，由三重态通过发射光子释放能量跃迁回到基态 单重态。应用生物分析； 药物分析；生物反应动力学过程研究（磷光免疫分析etc.）3.化学发光技术（Chemliuminescence CL）基本原理反应物或反应产物吸收了化学反应时产生的化学能，使

3、其分子或原子由基态 激发至激发态，而再跃迁回到基态时发出一定波长的光称化学发光。发光机理A + B = C* + DC*C + hA + B = C* + DC* + F = F* + CF*F + h应用无机物的分析；有机物的分析； 生物活性物质的分析；生物活性氧的分析免役发光分析；核酸杂交分析；微全分析系统中的应用4.电化学发光技术（ECL）原理ECL是利用电极原位产生试剂，这些试剂在溶剂中反应，完成较高能量的电子转移而生成激发态的分子，不稳定的激发态分子回到基态过程中以光辐射形式释放能量。向电解施加正负脉冲A+ + e-A+ + e-A2A*A + h负电位时，分子被还原：A + e-A

4、+ + A-A*ECL的应用 电致化学发光在化学修饰电极、生物传感器及核酸探针中的应用。电致化学发光在免疫分析中的应用。近红外电致化学发光。5.光声光谱光声光谱基本原理光声光谱指物质吸收光源或电子辐射后激发至激发态，然后经过无辐射跃迁（放热）回到初始状态一光能转变成热能的过程一进而测量。光声技术是测量样品内部热能，因而它即是量热技术，也是光谱技术。应用 无机绝缘体（绝缘体、半导体、金属材料等不透光或易反射的物体。）固体有机物（有机染料和有机半导体等吸收系数很大，光学上不透明的材料。）液晶（液晶的固态，近晶态和向列态等对光有强烈散射的物体。）表面研究（光声光谱技术可有效地用于研究金属、半导体甚至

5、绝缘体表面上吸收的各 种分子和化合物，如TLC分离后各物质的鉴定等）。生物医学生物大分子的真空紫外光声光谱和微量测定，通过同步加速器辐射产生的真空 紫外光束、气体传声器检测DNA溶菌酶、酵母细胞、胸腺嘧啶等多种生物分子、及农业产品的质量鉴定。细胞学研究鉴别细菌的状态，即通过光声光谱鉴别和区分不同的细菌状态，测定处于各种 发展阶段的细菌。植物光合作用的研究；白血病的病况和早期诊断探讨6旋光与圆二色性光谱圆二色性（circular dichroosim,简称 CD）和旋光色散（Optical rotatory dispersion,简称 ORD） 是研究分子结构不对称的方法，可用来检测生物大分子样

6、品在溶液状态下的构象，它能和X 射线衍射法有很好的互补性。X射线衍射法能够在晶体状态下了解分子结构，提供最详细 的资料，但不能提供有机生物大分子在溶液状态下的构象信息。旋光光谱非旋光活性介质：当一束平面偏振光通过某一介质时，左、右偏振光的传播速度不变（折 射率、散射率相同），入射光的振动方向不变，这种介质为非旋光活性介质。旋光活性介质：当一束平面偏振光通过某一介质时，左、右偏振光的传播速度发生变化， 合成后平面偏振光的振动方向发生改变，这种介质为旋光活性介质。光学活性物质：不能与它的镜像相互重叠，一定不具有中心对称、平面对称和旋转对称 轴的物质。由于在不同波长下，光的折射率不同，旋光度也不相同

7、，因此，当以波长为横坐标，旋光度 为纵坐标，可得旋光光谱谱线。不同的分子结构不同，旋光谱线的谱形也不相同。圆二色光谱因旋光活性物质含有生色基团，对特定的波长有吸收，且对左、右偏振光的吸收能力不 同，而使其共振峰幅度不同，这样不仅导致偏正光的速度不同，而且振幅也不同，这样两个 矢量就不是圆偏振，而是一个椭圆偏振光圆二色性应用手性化合物的结构分析 CD和ORD可在适当的情况下用来鉴定发色团在手性分子中的位置。对映性；邻近关系； 构象。溶剂效应溶剂一溶质之间的相互作用会影响分子的光学活性。手性介质诱导的光学活性若一个处于非手性分子被外部介质所诱导而 产生光学活性。手性化合物的结构分析用于研究蛋白质的

8、构象:蛋白质的a螺旋以及8折叠； 用于研究DNA结构7.激光拉曼光谱瑞利散射光子与物质分子碰撞时为弹性碰撞，碰撞过程没有能量交换，光的频率不 发生改变，光传播方向发生改变。拉曼散射光子与物质分子产身非弹性碰撞，发生能量交换，光子不但改变了方向，而且能量也发生变化：能量减少stokes线，能量增加anti-stokes线。对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子 结构研究的方法就是拉曼光谱。振动拉曼光谱是产生于分子诱导偶极矩的变化，即当分子中的原子在平衡位置周围振动时， 由于入射光的外电场作用，使分子的电子壳层发生形变，正负电荷中心发生相对位移所形成 诱导偶

9、极矩。应用 有机结构分析；高分子聚合物的研究（立规性、结晶度、取向度）；聚合物共混物的 相容性研究；聚合物固化过程监测；聚合反应过程监控；聚合物水溶液和凝胶体系中水的 结构和分子间作用力的研究；聚合物结晶过程监测和结晶度的测定8核磁共振核磁共振指（自旋运动的）原子核在磁场中能级分裂，对高频辐射产生共振吸收的物理现象。 基本原理 有些带正电的原子核和电子一样有自旋，原子核自旋的状况可用自旋量子数I 表示。I值为零的原子核可以看做是一种非自旋的球体，I为1/2的原子核可以看做是一种电 荷分布均匀的自旋球体，/大于1/2的原子核可以看做是一种电荷分布不均匀的自旋椭球体。 自旋的核因而产生磁场，由此具

10、有磁偶极矩（磁矩R）。磁矩不为零的原子核，在外磁场作 用下自旋能级发生能级分裂，共振吸收某一定频率的射频辐射。应用：确定生物大分子结构，在有机合成中，不仅可以对反应物或产物进行结构解析和构型 确定，还可以研究合成反应中的电荷分布及其定位效应，探测反应机理。定量分析和分子量的测定；高分子化学中的应用：聚合物类型的鉴定，有关聚合物链的异构化信息，聚合物微观信息; 在生命科学中的应用：医学，生物科学，材料科学。电子顺磁共振波谱（EPR）基本原理具有一定质量和带负电荷的电子自旋产生磁场，具有磁矩，在外磁场中有高低两种能量的自 旋取向。在垂直于外磁场的方向加上一定频率的电磁波，是电子恰好产生自旋能级上的

11、跃迁。 此即电子顺磁共振。且只有未成对的电子才有电子顺磁共振。应用 EPR主要应用于鉴定含有未成对电子的物质，自由基是EPR的主要研究对象。 研究过渡金属配合物，因为过渡金属具有未充满的d壳层，其配合物常有未配对电子。 研究配合物中过渡元素的价态、电子组态、配合物结构等。研究生物的光合作用、生物氧化、催化、核酸功能、生物衰老、癌变等。电子能谱（ES）一定能量的电子、X射线或紫外光作用样品，把样品表面原子中不同能级的电子激发成自由 电子，研究这些自由电子的能量分布就是电子能谱分析。基本原理 电子能谱的基本物理过程是光致电离。当能量为hv作用与样品时，样品中原子 或分子M的某一轨道上的电子吸收能量

12、被电离成有一定动能的光电子e-: M+hv =M+* +e-由能量守恒原理得EM +hv =EM+* +Ee即某能级的电子结合能Eb为：Eb = EM+* - EM = hv -EeXPS （X射线光电子能谱）采用能量为1000-1500 eV的射线源，能激发内层电子。各种 元素内层电子的结合能是有特征性的，因此可以用来鉴别化学元素。XPS可用来对固体表 面的元素进行定性分析。紫外光电子能谱（UPS）紫外光电子谱是利用能量在16-41 eV的真空紫外光子照射被测样 品，测量由此引起的光电子能量分布的一种谱学方法。忽略分子、离子的平动与转动能，紫 外光激发的光电子能量满足如下公式：由于光源能量较

13、低，线宽较窄（约为0.01eV）,只能使原子的外层价电子、价带电子电离，并 可分辨出分子的振动能级，因此被广泛地用来研究气体样品的价电子和精细结构以及固体样 品表面的原子、电子结构。俄歇电子能谱的基本机理是：入射电子束或X射线使原子内层能级电子电离，外层电子产 生无辐射俄歇跃迁，发射俄歇电子，用电子能谱仪在真空中对它们进行探测。电子能谱目前主要应用于催化、金属腐蚀、粘合、电极过程和半导体材料与器件等这样一 些极有应用价值的领域，探索固体表面的组成、形貌、结构、化学状态、电子结构和表面键 合等信息。UPS主要用于：1）清洁表面或有化学吸附物的表面的电子结构；2）参与表面化学键的金 属电子和分子轨

14、道的组合等信息；3）有关电子激发和电荷转移的信息。XPS是用X射线光子激发原子的内层电子发生电离，产生光电子，这些内层能级的结合能 对特定的元素具有特定的值，因此通过测定电子的结合能和谱峰强度，可鉴定除H和He（因 为它们没有内层能级）之外的全部元素以及元素的定量分析。AES也不能分析H、He，对样品有一定的破坏作用，但其具有表面灵敏度高（检测极限小 于10-18g）、分析速度快等优点，在表面科学领域主要进行：1）表面组成的定性和定量；2） 表面元素的二维分布图和显微像；3）表面元素的三维分布分析;4）表面元素的化学环境和 键合等方面的研究。十一、热分析（TA）热重分析（TG）在程序控制温度下

15、，测量物质重量与温度变化的关系的一种热分析方法。差热分析DTA在程序控制温度下，测量在样品池中试样与参比物（一种在测量温度范围内 不发生任何热效应的物质）之间的温度差（吸热或放热）与温度关系的一种热分析方法。 DTA比TG有更广泛的应用，因为DTA不仅限于质量变化的反应，还可用于结晶、相变、 固态均相反应以及降解等。差示扫描量热分析（DSC） DSC是在程控温度下，测量为补偿试样和参比物的温度差而输出 的功率差的一种热分析方法。第十章质谱（MS）质谱分析原理样品分子（或原子）在离子源中离化成具有不同质量的带电荷分子离子和碎片后，在加速电 场中获得动能形成离子束，离子束在磁场中，运动的轨道发生偏

16、转，因此，具有不同质荷比 的离子聚焦在不同点上，相同质荷比的离子聚焦在同一点上，形成不同质荷比的谱线一质 谱。应用。化合物的分子量和化学式在低分辨率的质谱图中的同位素一即利用分子离子与它的（M+1）,（M+2）等同位素离子的 相对丰度比来推导其元素组成。在高分辨质谱精密测定分子离子的精确质量，然后根据每一种同位素的原子量所特有的质量 亏损推出分子离子的元素。官能团和化合物的类型通过质谱中各种碎片离子的质荷比和丰度来提供有关化合物所含官能团和化合物的类型。基团之间的连接和空间结构质谱中一些重排离子属于一类特征离子的产生需要相关基团处于特定的空间位置，因此，这 些离子的存在能提供分子中某些基团的连

17、续次序或空间排列。质谱与临床医学除了应用于蛋白质和核酸研究以外，质谱还以其灵敏度和高分辨率在临床医学检直中得到 了广泛的应用，如对药物代谢产物的动态分析，癌细胞蛋白质的鉴定，同位素标记物的检 测等。其中用同位素14C标记的14C-尿素呼吸试验和15N标记的15N-排泄试验已成为临 床检测胃幽门螺杆菌（HP）的有效手段。ESI和MALDI质谱技术为寡核苷酸及其类似物的结构和序列分析提供了一种新的方法，它 是将被测寡核昔酸样品先用外切酶从3或5端进行部分降解，在不同时间内分别取样进行 质谱分析，获得寡核昔酸部分降解的分子离子峰信号，通过对相邻两个碎片分子质量进行 比较，可以计算出被切割的核昔酸单体

18、分子质量，将其与四个脱氧昔酸的标准分子量进行 对照，就可以读出寡核苷酸的序列。由于MALDI技术分辨率的问题，使得其更适合于减 基数较少的短链核酸的分析。热重分析（TG）在程序控制温度下，测量物质重量与温度变化的关系的一种热分析方法。差热分析（DTA）在程序控制温度下，测量在样品池中试样与参比物（一种在测量温度范围内不发生任何热 效应的物质）之间的温度差（吸热或放热）与温度关系的一种热分析方法。广泛应用于测 定物质在热反应时的特征温度及吸收或放出的热量。差示扫描量热分析（DSC）（Differential Scanning Calorimeter）是在程控温度下，测量为补偿试样和参比物的温度差

19、而输出的功率差的一种热分析方法。DTA因为样品变化前后的比热、热导率、加热率等于参比物的不一致性，导致测量的不 准确。由于DSC能对试样产生的热效应及时地补偿，使得试样于参比物之间无温差、无热 交换、试样升温与炉温同步。1、透射电子显微（TEM）透射电镜：是以波长极短的电子束作为照明源，用电子透镜聚焦成像的一种具有高分辨本 领、高放大倍数的电子光学仪器。四部分：电子光学系统、电源系统、真空系统、操作控制系统2、扫描电子显微（SEM）SEM的特点1965年第一台商用SEM问世;SEM能弥补透射电镜样品制备要求；景深大；放大倍数连 续调节范围大；样品制备非常方便；可直接观察大块试样；材料断口和显微

20、组织三维形态； 表面形貌分析； 配置各种附件，做表面成份分析。SEM的成像原理扫描电镜的成像原理，和透射电镜大不相同，它不用什么透镜来进行放大成像，而是 象闭路电视系统那样，用电子束在样品表面逐点逐行扫描成像。由三极电子枪发射出来的电子束，在加速电压作用下，经过2-3个电子透镜聚焦后，在样 品表面按顺序逐行进行扫描，激发样品产生各种物理信号，如二次电子、背散射电子、吸 收电子、X射线、俄歇电子等。这些物理信号的强度随样品表面特征而变。它们分别被相应的收集器接受，经放大器按顺 序、成比例地放大后，送到显像管。供给电子光学系统使电子束偏向的扫描线圈的电源也是供给阴极射线显像管的扫描线圈的电源，此电源发出的锯齿波信号同时控制两束电子束作同步扫描。因此，样品上电子束的位置与显像管荧光屏上电子束的位置是一一对应。这样，在荧光 屏上就可显示样品表面起伏的二