DB12-T200-2004鲜番茄及番茄制品中转基因成分的定性检测方法

1、DB12/T 2002004DB12/T 2002004ICS 65.020.01B04备案号：市 地 方DB12/T 2002004鲜*茄及番茄制品中转基因成分的定性检测方法：0col of the qualitative detection for traiisgenic componentin fresh tomato and tomato processed products：0 DMIF-GEN-T1B2 DMIF-GEN-T1B?、DMIFGENT 1B4和本标准在呻息用于检测尊番茄和番茄制品内源基因和外源基因的引物序列时,釆用了欧盟推荐的检 测方法，耳DMIF-GEN-T本标准由

2、或SMT4-CT96-2072 ,本标准起耳单艮天津带农产品质量监督检验测试中心、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主缽起葦人：金红、赵昕、王永、程奕、郑贵忠。DB12/T 2002004DB12/T 2002004 DB12/T 2002004 部转入50 mL离心管中。用0.1 mol/LTris-HCl (6.3.14)溶液反复洗涤样 入 30 mL 0.1 mol/L Tris-HCl 溶液(6.3.14),反复摇匀，于 4C 10 000 r/min 离心 留沉淀用宇DNA提取。研钵中，置于冰品三次，方应为力15 min,弃上灣，取鲜番茄样風2g,置煎冷研钵中，加入液氮(6

3、.3.30)衲磨成粉末状，转入2 mL离心管中，用 于DNA提取。6.4.1.2 CTA.研细，全B传提取 取经预处理浦样品加入时，期间每隔 加入等体积的丰色 加入等体积的三氯| 摇匀，室温静亶1离心10 min,取上i 留的乙醇，待* 淀，加入100卩LT6. 4.2样品中dImL溶解沉淀,4 C静置过夜,6. 4. 2. 1紫外分丿釆用紫外分光 的最佳范围是2 Mg 外分光光度计的比 链 DNA。PCR 皴釆用内源曇10 mL经65C预热的CTAB提取缓冲掖(6. 3. 10),混匀。65C水浴1小彳到混匀一次，取出静置冷却至室温，12 000 r/min离心12 min,取上清,0 mi

4、n轻轻颠甲烷+异戊醇(6. 3. 8)缓慢颠倒摇匀5 min,于10 000 r/min离心10 min,取上清， 甲烷+异彼醇(6. 3. 8)重复抽提一次，取上清，加入2倍体积的CTAB沉淀液(6. 3.11), 牛时，12 600 r/min离心10 min,弃上清，沉淀加入1.2 mol/LNaCl溶液(6. 3. 12) 冒静置5 min,加入等体积三氯甲烷+异戊醇(6. 3.8)颠倒摇匀1 min,于12 000 r/min 加入的3 mol/L乙酸钠(6. 3. 13)和等体积的冷异丙醇(6. 3. 7),缓慢混匀,ICO r/min *心15 min,弃上清，加入400成J。冷

5、乙醇(6.3.9)洗涤沉淀，除去残 午燥后，“入30虬灭菌的去离子水(6.3. 20)瀋解从番茄加工制品提取的DNA沉 E (6. 3.15)溶解从鲜番茄提取的DNA沉淀,均置-20C保存备用。“产量和此的鉴定,光度法*度法对M鲜番茄中提取的DNA进行产量和质貴的鉴定。紫外分光光度法检测核酸 Ll50 MgjmL, OD值应该在0.051的区间内。将DNA溶液做适当的稀释，放入紫 g皿中，亍260|nA 溶液OD260nmtD280nm 比值为 1.72.0。因增法鉴言从番茄加士制品中提取的DNA的质量。通过PCR技术，扩增番茄内源nm处测定其吸收峰，lOD260nm=50 Pg/mL双链DN

6、A或38 Pg/mL单基因。6. 4.3 基因。6. 4.3 定性 fC6.4. 3.1 PCR检测鲜番茄秤2o反应体系中各盘6. 4. 3. 2反应体 进行PCR&i 基因番茄材料申由 的DNA为模板；金测7体系为原料的番茄加工制品中内源基因和外源基因釆用的PCR检测体系见表为原料的番茄加工制品中内源基因和外源基因釆用的PCR检测体系见表剂的量根歩反应体系:的总体积进行适当调整。每个反应体系应该设置两个平行管。 2 PCR也测参考反应体系(25凹L体系)试剂名加入PCR反应体系的量lOxPCR 即缓F液2.5 卩L氯化镁(25 I1/L)2.0虬dNTP溶液(I 2.5 mmol/I,)2.

7、0吒正向引物(1)prjlOl/L)2.5吒反向引物(1)P1。皿)2.5 卩LTaq 酶(2U/丄L)2.0模板(样曲學ID!A)810虬水补足反应体系，使单、体积为25卩L注：表中阳伯对J仲和阴性对卩，的DNA模权用量取IPL。时照的設i必须设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：用Nema282F转必须设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：用Nema282F转的DNA件为PCR反应体系的DNA模板；阴性对照：用非转基因番茄材料中提取 一日对照：神置反应林系的实验用水代替模&。6. 4. 3. 3样品申内箱基因和亦源基因的检测DB12/T 2002004 检测鲜番W和*番茄果为原

8、料的番茄加工制品中的内源基因和外源基因的PCR检测的参考反应 条件见表3。反国遂件需根航检测仪器拓能做相应调整。被扩增軒星PG34-CaMV35NOSPG变性94*jc, 3 min94 , 3 min1A扩增 94C, 30s 60C, 30s 72C, 45s 94C, 30s 54C, 40s 72C, 60s 94C, 30s 60C, 60s 72C, 45s；循杯次数i备3540351*-最后延伸72C, 5 min72C, 3 min72C, 6 min95 &,5 minPG34L-NCs95 C,5 min94C, 30s60C, 60s72C, 60s3572C, 6min

9、NptII(215tf卬)j94C,3 min94C, 30s62C, 30s72C, 60s4072C, 5 minNptll (173 t屮）r94 ,C5 min94C, 60s58C, 60s72C, 60s4072 C, 7 min表3样品中内源蓦因和外源基因的PCR参考反应条件6. 4. 3. 4凝胶电津耳測PCR产物用IxTAE 液制备*的琼脂糖凝胶（凝胶融化后晾宇6OC左右时加入漠化乙锭，含量为 0. 5g/mL）o按btw|10 vlL的产物%上样缓冲液均匀混合，笑后如入对应的凝胶孔中，同时加入 合适的DNA分予軻记物，选*合适的电压（3 V/cm5 V/cm）进彳亍电|泳，

10、电泳时间为40 min60 min。 6. 4. 3. 5 破击电泳结束后，M 增出的目的条带的村 6. 4.4结果分析妆 6. 4. 4.1内源基弓的对于番茄特异邮出现383bp的条希，贝，则不能用于检测糙因，应该言新提取福测样品DNA,直到能扩383bp的条带，防止检测中产 生假阴性。6. 4. 4. 2外源基因对待测样品取液进彳亍外源基因的PCR检测，如果阴性和鹽和空白对照未出现条带，阳性 、 I 师期大小国扩增条带j,则可判断待测样品中含有源基因。茄制*中转基凤成分的检神，可参考表1的内容，先诫选检测CaMV35S、NOS、NptII 基因，筛选检测飒阴*则直接只告结果。： -，则需3一步鉴定检测外源目的基因片段PG344-NOS,以确定是否为转基因番許（照相?脂糖凝胶*于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标记判断扩 ，将电泳结果形成俄子文件存档或用照相系统拈照。度测源基因P34片段啟检测，如果阴性对照、待测样品和阳性对照的PCR产物都 |表明提取待测样4DNA符合PCR反应的要求，能用于外源基因的检测；否:測对照和待测样品均出对鲜番茄和番若筛选检测绡果 茄 Nema282F 品系 |。若阴性对照，兩京基因得至扩增外，菸有