结核杆菌H37Ra免疫小鼠后脾淋巴细胞的杀伤活性及免疫机制的研究

1、结核杆菌H37Ra免疫小鼠后脾淋巴细胞的杀伤活性及免疫机制的研究王利娴,卢贤瑜,李惠,阳强【关键词】结核杆菌H37Ra;,Ag85B卵白;,小鼠淋巴细胞;,穿孔素;,颗粒酶BStudyntheyttxiityfspleenlyphytesandiuneehanissinieiunizedbyybateriutuberulsisH37RaAbstratAI:TexplrethespeifiyttxiityfspleenlyphytesandtheiuneehanissinieiunizedbyybateriutuberulsisTBH37Ra.ETHDS:Atthevariusinterval(

2、30days,60days)aftertheieereiunizedbyTBH37Ra,BGandPBS,thespleenlyphytesftheiunizedieereusedastheeffetrellshiletheSp2/0ellsexpressingtheseretedprtEinAg85Bereusedasthetargetells,andtheyttxiityfspleenlyphytesintheiunizedieaseasuredbyTTassay.Spleenlyphyteserelletedat60daysafteriunizatinandstiulatedithPPD

3、,andtheexpressinfperfrin,granzyeBnRNAlevelasdetetedbyRTPR.RESULTS:TheyttxiityfspleenlyphytesinthegrupiunizedbyTBH37RaassignifiantlyhigherthanthatfPBSntrlgrup(P005),andslightlyhigherthanthatfBGgrup.TheRNAexpressinfperfrin,granzyeBinH37RagrupandBGgrupassignifiantlyhigherthanthatinPBSntrlgrup(P005);the

4、expressinfperfrinRNAinH37RagrupassignifiantlyhigherthanthatinBGgrup(P005),butthereasnbviusdiffereneithregardttheexpressinfgranzyeBRNAbeteenH37RagrupandBGgrup.NLUSIN:TheyttxiityfspleenlyphytesisenhanedafterieereiunizedbyTBH37Ra,hihayberelatedttheexpressinfperfrinandgranzyeB.KeyrdsTBH37Ra;Ag85Bprtein;

5、spleenlyphyte;perfrin;granzyeB摘要目的:探究结核杆菌H37Ra免疫小鼠后,产生特异性的脾淋巴细胞杀伤活性及其免疫机制。要领:(1)别离以结核杆菌H37Ra、BG和PBS免疫小鼠后第30天及第60天,分散各组小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞,以表达Ag85B排泄卵白的Sp2/0细胞为靶细胞,用TT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的杀伤率;(2)在免疫后第60天,小鼠脾淋巴细胞经PPD刺激后,以RTPR法检测穿孔素RNA及颗粒酶BRNA的表达。结果:(1)结核杆菌H37Ra组脾淋巴细胞的杀伤率显着高于PBS比拟组(P0.05),略高于BG组;(2)H37Ra组和BG组穿孔素、颗

6、粒酶RNA的表达量均明显高于PBS组P0.05,H37Ra组穿孔素RNA的表达量明显高于BG组(P0.05),但颗粒酶BRNA的表达量两组无差异。结论:结核杆菌H37Ra免疫小鼠后,能加强脾淋巴细胞的杀伤活性,其机制大概与增长穿孔素、颗粒酶B的表达有关。关键词结核杆菌H37Ra;Ag85B卵白;小鼠淋巴细胞;穿孔素;颗粒酶B比年来,由于生齿活动的增长,多重耐药菌株的盛行,以及结核分枝杆菌TB和HIV的双重熏染,导致TB的发病率和殒命率大副度进步。而如今惟一获准利用的卡介苗BG的防范结果又不甚抱负,对差异的人群庇护力差异较大,因此,天下各国加强了对宿主对抗结核杆菌免疫机制的研究。H37Ra是由H

7、37Rv人型结核分枝杆菌尺度毒株屡次传代后得到的无毒株。国表里文献报道,H37Ra具有毒力较低、抗原性完备1,2及能充实活化巨噬细胞3,4等长处,因此,结核杆菌H37Ra作为侯选减毒活疫苗具有相对的上风。然而怎样进步D8+T细胞的特异性杀伤活性,是研制新型抗结核疫苗急迫必要思量的题目。以往结核疫苗的研究中,有关特异性小鼠脾淋巴细胞杀伤作用的研究较比菲薄。Ag85B是结核分枝杆菌的重要排泄卵白,可诱发对TB的庇护性免疫应答。本研究中拟用能表达此目的卵白的Sp2/0细胞为靶细胞,检测结核杆菌H37Ra免疫小鼠后,诱导机体产生特异性脾淋巴细胞杀伤活性的结果,并从分子程度上检测穿孔素、颗粒酶RNA的表

8、达,以探究小鼠脾淋巴细胞抗TB熏染的免疫机制。1质料和要领1.1质料携带有Ag85B排泄卵白基因的真核表达质粒pTB30,由华中科技大学同济医学院微生物教研室范雄林博士奉送,本室保存。结核杆菌H37Ra、BG菌株由本室保存。Sp2/0细胞由重庆医科大学熏抱病研究所提供。Lipfetaine2000购自美国Invitrgen公司。总RNA提取试剂Trizl购自上海生工公司。RTPR试剂盒购自TaKaRa公司。PPD尺度品购自成都市生物成品研究所。抗Ag85B排泄卵白的多克隆抗体本室制备。HRP标识表记标帜的羊抗鼠IgG及二氨基联苯胺(DAB)购自北京中杉公司。G418、RPI1640造就液、TT

9、和淋巴细胞分散液,均购自北方同正公司。小牛血清购自GIB公司。SPF雌性57BL/6小鼠,68周龄,质量1820g,购自重庆医科大学实行动物中央。1.2要领2结果2.1Sp2/0细胞中Ag85BRNA及其卵白表达的检测1琼脂糖凝胶电泳阐发:转染重组质粒的Sp2/0细胞的裂解液在880bp处出现一条显着的带,而未转染重组质粒Sp2/0细胞的裂解液那么无此条带,表白转染的细胞中有Ag85BRNA的表达(图1)。2免疫细胞化学染色检测:转染的Sp2/0细胞经G418挑选后,别离用抗Ag85B排泄卵白的多克隆抗体作为一抗和HRP标识表记标帜的羊抗鼠IgG作为二抗,结果表现,Sp2/0细胞中有棕黄色的颗

10、粒,表白其可表达Ag85B排泄卵白图2。图1Sp2/0细胞中Ag85BRNA表达的检测略Fig1AnalysisfAg85BRNAexpressininSp2/0ells1:NntransfetedSp2/0ells;2:Sp2/0ellstransfetedbypTB30;3:DNAarker.图2Sp2/0细胞中Ag85B卵白表达的免疫细胞化学染色检测略Fig2DetetinfAg85BexpressininSp2/0ellsbyiunytheialstaining4002.3小鼠脾淋巴细胞杀伤活性的检测TT比色法检测表白,免疫后第30天、第60天,H37Ra免疫组和BG免疫组小鼠脾淋巴细

11、胞的杀伤率明显高于PBS组(P005),H37Ra免疫组的杀伤率略优于BG免疫组(P005,表1)。表1小鼠脾淋巴细胞特异性杀伤率的检测略Tab1DetetinfthespeifiyttxiityfiespleenlyphytesaP0.05vsPBSgrup;P0.05vsBGgrup.2.4脾淋巴细胞中穿孔素及颗粒酶BRNA的表达RTPR产物的琼脂糖凝胶电泳表现:H37Ra组和BG组小鼠脾淋巴细胞裂解液中穿孔素及颗粒酶BRNA的表达量均明显高于PBS组P005。H37Ra组与BG组比拟力,穿孔素RNA的表达量有统计学差异P005;而颗粒酶BRNA的表达量,前者略多于后者但无统计学意义图3、

12、图4。图3小鼠脾淋巴细胞中穿孔素RNA表达的检测略Fig3DetetinftheperfrinRNAexpressininiespleenlyphytes:DNAarker;1:BGiunizatingrup;2:H37Raiunizatingrup;3:PBSntrlgrup.2.5脾淋巴细胞颗粒酶RNA的表达免疫小鼠脾淋巴细胞颗粒酶基因PR产物的电泳结果见图4A,基因表达的相对值见图4B。结果表现H37Ra组和BG组颗粒酶RNA的表达量明显高于PBS组P005,H37Ra组略高于BG组,但无统计学差异。图4小鼠脾淋巴细胞中颗粒酶BRNA表达的检测略Fig4Detetinfthegranzy

13、eBRNAexpressininiespleenlyphytesA:AnalysisfgranzyeBRNAexpressinbyagarsegeleletrphresis.:DNAarker;1:H37Raiunizatingrup;2:BGiunizatingrup;3:PBSntrlgrup.B:TherelativedensityfgranzyeBRNAexpressin.3讨论Ag85B是结核分枝杆菌的重要排泄卵白。本研究中以携带有Ag85B排泄卵白的真核表达质粒pTB30转染Sp2/0细胞后,用RTPR法检测在Sp2/0细胞内有Ag85BRNA的表达。免疫细胞化学染色表白,转染重组

14、质粒的Sp2/0细胞中有Ag85B卵白表达。接纳TT法检测小鼠脾淋巴细胞特异性杀伤率,此法轻便易行,无需预标靶细胞,与51r开释法比力相干性好,还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。本实行表白,以结核杆菌H37Ra和BG免疫57BL/6小鼠后,均可产生Ag85B排泄卵白,从而便可诱导小鼠脾淋巴细胞特异性地杀伤Sp2/0靶细胞,且表现H37Ra组小鼠脾淋巴细胞的杀伤率略优于BG组,提示结核杆菌H37Ra具有较好的免疫原性,免疫57BL/6小鼠后可诱导特异性的细胞免疫应答。检测脾淋巴细胞中穿孔素、颗粒酶BRNA表达的结果表白,穿孔素RNA的表达量明显高于BG免疫组,与脾淋巴细胞杀伤活性的结果相符

15、合,其杀伤机制大概与细胞中穿孔素、颗粒酶BRNA表达增长有关。BG不克不及有用刺激D8+T细胞,从而导致个别产生的庇护力有限,外洋文献报道7,8特异性D8+T细胞对靶细胞的杀伤成效在抗结核分枝杆菌熏染中具有紧张的作用。本研究未分散D8+T细胞,但其结果为结核疫苗的研制提供了必然的实行根据。参考文献:1styS,usinsD,BrinkanJ,etal.GenideletinssuggestaphylgenyfrtheybateriutuberulsisplexJ.JInfetDis,2002,186(1):74-80.2DhianN,KhullerGK.Iunreativityfpeptide

16、sgeneratedbyliitedprtelysisf71kDaellallprtEinfybateriutuberulsisH37RausingPLGirpartilesJ.LettApplirbil,2000,30(5):345-350.3Sank,Satk,San,etal.parativeprfilesfintraarphagebehavirfybateriutuberulsisandybateriuaviuplexithdifferentlevelsfviruleneJ.irbilIunl,2002,46(7):483-486.4陶昆,卢贤瑜.H37Ra皮内接种对巨噬细胞的激活效应J.中国人兽共患疾病学报,2022,22(3):232-235.5范雄林,徐志凯,白光春,等.结核杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建J.细胞与分子免疫学杂志,2000,16(4):314-315.6BalkS,KerstenA,TranTT,etal.nertedatinftheFasL/Fasandperfrin/granzyeAandBpathaysisandatryfrthedevelpentfearlyviralhepatitisbutntfrreveryfrviralinfetinJ.JVirl,2001,75(18):8781-8791.7anadayDH,ilk