蛋白质的分离与提纯课件

1、蛋白质的分离纯化（SDS电泳）报告人：左圣升 韩东升 宋昊东PART 1化1003班 左圣升蛋白质蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，其理化性质一部分与氨基酸相同或相似，如两性电离、等电点、紫外吸收性质和呈色反应等；也有一部分又不同于氨基酸，如高分子量、胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。 蛋白质分离纯化意义 蛋白质和酶在生物体内催化代谢反应、物质运转、运动的 相互协调、兴奋的传导、生长与发育的控制等过程中都起重要的作用。因此，研究蛋白质对了解生命规律、指导工业生产、医药实践有着重大的理论与实践意义，而蛋白质的分离与纯化是蛋白质研究中必不可少的一个环节，必须要了解目的蛋白的分子量、等电点、溶解性及

2、稳定性等基本性质才能制定由合理的分离纯化方法。蛋白质的理化性质蛋白质的两性解离蛋白质的胶体性质蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质的紫外吸收蛋白质的呈色反应分离基础鉴别和检验蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质的变性蛋白质的沉淀：蛋白质分子凝聚而从溶液中析出的现象。蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链相互缠绕，继而聚集，因而从溶液中析出，产生沉淀。变性的蛋白质易于沉淀；有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。凝固是蛋白质变性后进一步发展的一种结果。近20年，生物技术有了很大发展。但是，对于大多数生物技术产品来说，必需经过分离纯化，即所谓后处理过程，达到一定的质量标准后，才是可用产品。根据目前经验，大多数生物技术产

3、品的研究开发中，约40-80%的资金用于后处理过程，而精细产品，基因工程产品比例更高。另外，分离纯化技术不仅影响产品质量，在一定程度上也影响着产量。分离纯化技术已成为生物技术领域中的关键技术之一。利用遗传工程的方法对目的产物，主要是蛋白质的组成予以改变或对某些部分加以修饰，使某些性质改变，使之有利于分离纯化如利用遗传工程的方法，将凝聚因子引入，使细胞在培养过程中凝聚，以便容易进行细胞分离前景前景蛋白质的分离与纯化方法简介PART 2化1003 韩东升蛋白质的分离与纯化（一） 蛋白质的理化性质（二） 分离纯化蛋白质的方法蛋白质的分离纯化方法一、离心法二、沉淀法三、透析法四、过滤法五、层析法六、电

4、泳法蛋白质的分离纯化方法透析法大分子的蛋白质不能通过半透膜而滞留在透析袋内；小分子的物质可以自由进出透析袋，直到它在透析袋内外的浓度相同，即达到平衡，而使大分子与小分子分开。过滤法利用不同孔径的介质，截留一定大小的颗粒。层析法以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质 电泳法离心法沉淀法返回透析法返回过滤法返回层析法返回电泳法BACKWelcome PART 3NOW何为SDS电泳法？sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳

5、作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。 原理： 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶 、SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS） 非变性聚丙烯酰胺凝胶：电泳过程中，蛋白质保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。 SDS：仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初于建立1967年，在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 对蛋白质的分离可通过在各种凝胶中的电泳完成，聚丙酰胺凝胶最常用。凝胶通过单体丙烯酰胺的聚合成链以及链的交联

6、而形成的半固态模型，注入到一对玻璃板之间。 凝胶孔隙大小可通过调整聚丙烯酰胺和交联剂的浓度而改变。高交联=毛孔非常小。 这样的凝胶可通过小蛋白和多肽,但不能通过大的蛋白质。小分子蛋白质通过凝胶的迁移速度比大分子蛋白质快。 凝胶的孔径和电场的强度影响运动速度。 蛋白质在进入凝胶电泳之前先暴露在离子洗涤剂SDS中。SDS将蛋白质用负电荷包裹，被包裹的多肽链可以通过相对分子质量分离。 即使是相对分子质量相差不足10%的多肽链也可以分离！ 可通过比较未知蛋白质在凝胶中迁移的距离与与已知分子量的蛋白质在凝胶中迁移距离来确定其相对分子质量。 SDS的作用消除了形状差异的影响 链的长度=蛋白质迁移速率的唯一决定因素要点补充分离纯化整体流程蛋白质样品 等电点聚焦分离 SDS (根据所带电量) （根据相对分子质量）第一步：一维根据所带电荷不同将蛋白质混合物样品分离为几组第二步：二维将每组带电量相同的不同蛋白质，根据相对分子质量不同，用SDS电泳进一步分离第一步分步图解蛋白质移动到其特定的pI值位置，pI值相同的蛋白质可用凝胶电泳进一步分离分