实验2 蛋白质的分离纯化课件

1、蛋白质的分离纯化离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶实验二一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验基本原理1、离子交换层析 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高

2、时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。基质电荷基团反离子阳离子交换剂电荷基团反离子阴离子交换剂电荷基团反离子基质基质溶液中的离子或离子化合物溶液中的离子或离子化合物可逆交换可逆交换2、酶活性检测 蔗糖酶（-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。同时，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用3.5二硝基水杨酸法，其原理是

3、3.5二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。 本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用3.5二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。2、样品处理： 将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于10ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；4 12000r/min, 离心10分钟，收集样品上清液（样品）测量总体积(ml数），留取1ml（样品）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定以及用于SDS分析；将其余样品（样品）作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶(可先取50u

4、l酶液做酶活力检测）。3、纯化检测仪器连接： 将梯度混合器(100ml梯度杯)，层析柱（1.020 ），恒流泵 (10rpm) （流速0.20.6 ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A），记录仪（纸速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（34 ml/管）等按下图连接并设置好。 211、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液2、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（ 1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液梯度混合器层析柱（1.020 ）恒流泵核酸蛋白检测仪记录仪部分收集器DEAE- Sepharose Fast Flow纯化检测仪器连接

5、示意图6、洗脱（梯度洗脱法）： 待未吸附的杂蛋白洗脱完全后（此时层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定），改用梯度为0-1mol/L NaCl 的梯度缓冲液进行洗脱。层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml 0.02mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液和50ml含1mol/L NaCl的0.02ml/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。洗脱流速不变，每3-4ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。跟踪测定各管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积（ml数）（样品），并留样用于后续实验 ，样品20低温保存备用。7、蔗糖酶活力检测空白对照 样品管0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.50.5ml0.5ml5%蔗糖溶液0.5ml0.5ml分离纯化样品溶液/0.02ml 50水浴5min 3.5二硝基水杨酸试剂 0.5ml0.5ml 100水浴5min 蒸馏水5ml5ml观察颜色 收集活力高的蔗糖酶液，测量总