医学免疫学 实验一 斑点印迹（Dot boltting）

1、医学免疫学实验一 斑点印迹（Dot boltting）免疫实验课要求1.穿白衣进实验室，不要携带与实验无关的东西到实验室2.准时上课，不要迟到3.积极思考，勤动手4.实验报告重点在结果分析和实验小结5.注意实验桌面的整洁A和B两管试剂，不小心搞混了，已知这两样品一管是匙孔血蓝蛋白（KLH），另一管是全组份白蛋白（BSA)，请用免疫学方法来确定A和B是什么？ Blotting将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程称为印迹技术（blotting）。 Southern在1975年首先提出了分子印渍的概念。他将琼凝胶电泳分离的 DNA片段在凝胶中进行变性使其成为单链，然后将一张硝酸纤维素(n

2、itrocellulose， NC)膜放在凝胶上，上面放上吸水纸巾，利用毛细管作用原理使凝胶中的DNA片段转移到 NC膜上，使之成为固相化分子。载有DNA单链分子的 NC膜就可以在杂交液与另一种带有标记的 DNA或RNA分子(即探针)进行杂交，具有互补序列的RNA或DNA结合到存在于 NC膜的 DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子的区带。生物大分子印迹技术发展极为迅速，己广泛用于 DNA、RNA、蛋白质的检测。通常人们将DNA印迹技术称为Southern blotting，将RNA印迹技术称为Northern blotting，将蛋白质印迹技术称为Western blo

3、tting，将不经凝胶的印迹技术称为斑点印迹（Dot blotting）。Dot blotting原理：硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，在中性条件下，可有效地吸附蛋白质等生物大分子。因而，将抗原吸附于纤维素膜后，就可利用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。当加入抗体后再加入带有标记物的抗体，使标记通过抗抗体和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物,呈现斑点状着色,从而判定结果。 分类：根据所用的标记物不同，可分为： 辣根过氧化物酶免疫斑点试验， 碱性磷酸酶免疫斑点试验 金银染色免疫斑点试验(使用胶体金作为抗抗体的标记物)等

4、。 Western blotting可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析，作为一种廉价、便捷、可靠的研究工具，将与质谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。 抗原分子中可被抗体识别的表位性质。因为涉及到抗原样品的变性，只有那些识别耐变性表位的抗体可以与抗原结合。多数多克隆抗体中或多或少含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹中常选用多克隆抗体。蛋白原液中抗原的浓度。一些表达量低的蛋白在免疫印迹前常需要通过免疫沉淀，亚细胞分离等手段富集。影响免疫印迹的主要因素点样Dot blotting DAB，二氨基联苯胺是过氧化物（POD)的底物，与POD发生反应，与反应部位

5、产生棕色沉淀物。步骤：点样：将AB两管中的试剂各1l点在NC膜上,做好标记，于37恒温箱中干燥30min，封闭：5%脱脂奶粉/PBS室温摇床封闭60min，洗膜：PBS-T摇床洗3min/次3,最后一次用滤纸吸干，加入酶标抗体：HRP-anti-KLH,室温孵育60min, 取4lHRP-anti-KLH，用PBS 1：500稀释至2ml洗膜：PBS-T摇床洗3min/次3,最后一次用滤纸吸干，加底物显色液：DAB显色。出现斑点后，取出，放入清水中停止显色。请根据结果判定AB试剂可能是什么。 DAB致癌，操作时戴手套！所用实验用品需浸泡24h。实验所用主要试剂NC膜：Andy Bio 货号DA

6、B显色液：Andy Bio 货号 DA1010 脱脂奶粉：BD 货号4049465酶标二抗：Absea注意：实验过程中NC膜不能用手直接接触，请用镊子或戴手套！实验报告：每人写一份！将NC膜用透明胶粘在实验报告上。 Deadline：12月3日中午11：00！ECLECL显色原理 发光液A和B分别是鲁米诺和过氧化氢，在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在发光过程中不需要消耗HRP,HRP只是起催化作用，所以只要HRP没降解失活,是可以重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶,在