论小麦高分子量谷蛋白14亚基(HMWGS14)基因的原核表达课件

1、论小麦高分子量谷蛋白14亚基(HMWGS14)基因的原核表达课件论小麦高分子量谷蛋白14亚基(HMWGS14)基因的原核表达小麦高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因的原核表达 摘要关键词前言材料与方法结果与分析讨论结论参考文献致谢小麦高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因的原核表摘要 用限制性内切酶 EcoR和Sal双酶切pMDHMW,回收长约2.2kb的高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因，将其亚克隆到表达载体pET-30a(+)的相应位点上，构建了该基因的原核表达载体pET-HMW 。SDS分析结果显示，经IPTG诱导，高分子量谷蛋白14亚基(HMW-GS14)

2、基因在大肠杆 Rosetta(DE3)pLysS中得到了表达。 摘要 用限制性内切酶 EcoR和Sal双酶切pAbstract After slicing the pMD-HMW with two restriction endonucleases EcoRand Sal,recollect the high molecular weight glutenin subunit 14(HMW-GS14) gene which is about 2.2kb in length, then subclone it into the relative site of the expression ve

3、ctor pET-30a(+),and eventually the prokaryotic expression vector pET-HMW is constructed . The analysis result of SDSshows that after induction of IPTG, the high molecular weight glutenin subunit 14 (HMW-GS14) gene is expressed in the E.coli Rosetta(DE3)pLysS Abstract After slicing the p关键词高分子量谷蛋白14亚

4、基基因 原核表达 亚克隆 关键词高分子量谷蛋白14亚基基因 Keywords HMW-GS14 gene prokaryotic expression subclone Keywords HMW-GS14 gene 前言 小麦是最重要、种植面积最广的粮食作物之一。由于高产量新品种的选育推广、耕作栽培技术的提高及农业投入的增加，我国小麦产量不断提高，数量上暂时告别短缺。然而，随着社会饮食业、旅游业的发展和人民生活水平的提高，以小麦面粉为原料的各种精致面食和方便食品、保健食品及营养食品的生产增长很快，使得全国各地对小麦特别是优质小麦的需求，呈现不断增长的势头，并对小麦的品质提出了更高的要求。 前言

5、 小麦是最重要、种植面积最广的粮食作物之一。由于高 小麦的加工品质与小麦种子中麦谷蛋白及醇溶蛋白的含量和组成关系极为密切，高分子量麦谷蛋白与加工品质之间的关系已通过遗传、分子结构分析、显微电镜等方法得以阐明。在不同高分子量麦谷蛋白亚基对加工品质的贡献的研究中,发现5+10亚基为优质亚基，而2+12亚基为劣质亚基。然而我国的一些优质小麦品种如小偃6号（亚基组成为1，14+15，2+12）等缺乏5+10，而且具有被认为是劣质的2+12亚基。分析结果表明，导致其优质的原因在于其所具有的14+15亚基，14+15亚基具有5+10亚基的功能 。因此，研究14+15亚基功能对于从分子水平上改良小麦品质具有

6、重要意义。 小麦的加工品质与小麦种子中麦谷蛋白及醇溶蛋白的 本研究拟在以前的工作基础上，构建高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因的原核表达载体，并实现其在大肠杆菌表达宿主菌株Rosetta(DE3)pLysS中的特异表达，为进一步纯化HMW-GS14及研究其功能、性质奠定基础。 本研究拟在以前的工作基础上，构建高分子量谷蛋白14材料与方法 （一）材料 （二）方法 材料与方法 （一）材料 （一）材料 1.菌株和质粒： 大肠杆菌JM109菌株、 Rosetta(DE3)pLysS菌株、含HMW-GS14基因的重组质粒pMD-HMW以及原核表达载体pET30a(+)均为本实验室提供。 2.

7、酶与试剂：限制性内切酶EcoR和Sal购自大连宝生物工程有限公司，凝胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司，T4DNA ligase购自Promega公司，其他酶与试剂均为本实验室常规储备。（一）材料 1.菌株和质粒： 大肠杆菌JM109菌株、 （二）方法 1. pMD-HMW的提取 2. pMD-HMW的酶切鉴定3. 连接反应 4. 感受态细胞的制备 5. 转化 6. 菌落PCR 7. 重组表达质粒pET-HMW的提取与酶切鉴定 8. 重组表达质粒pET-HMW转化表达宿主菌 9. 诱导表达及SDS分析 （二）方法 1. pMD-HMW的提取 1. pMD-HMW的提取 挑取含有重组质粒p

8、MD-HMW的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中（含氨卞青霉素 100ug/ml）,于37，180rpm振摇培养1214h。 含有原核表达载体pET-30a(+)的单菌落（卡那霉素 50ug/ml）做相同处理。 然后按照“SDS碱裂解法”小量制备质粒pMD-HMW和pET30a（+）。 1. pMD-HMW的提取 挑取含有重组质粒pMD-HMW的2. pMD-HMW的酶切鉴定 用限制性内切酶 EcoR和Sal双酶切重组质粒pMD-HMW。在20ul酶切体系中，加入10ul pMD-HMW、2ul 10buffer、1ul EcoR、1ul Sal和6ul ddH2O。置于37水浴中,酶切2

9、3h。1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。 2. pMD-HMW的酶切鉴定 用限制性内切酶 EcoR和3. 连接反应 重组质粒pMD-HMW用限制性内切酶 EcoR和Sal双酶切处理，回收HMW-GS14基因（长约2.2kb），同时原核表达载体pET-30a(+)也用EcoR和Sal双酶切处理。将酶切处理后的pET-30a(+)和回收的HMW-GS14基因进行连接。20ul连接反应体系：ddH2O 4ul、目的基因片断 10ul、原核表达载体 3ul、10buffer 2ul、T4DNA ligase 1ul。于16，过夜连接。连接产物可以暂存于-40备用。 3. 连接反应 重组质粒pMD-HMW

10、用限制性内切酶 Eco 4.感受态细胞的制备 挑取大肠杆菌JM109单菌落，接种于5ml LB液体培养基中；37，180rpm,振摇培养1214h；吸取1ml过夜菌液, 转入50ml新鲜LB液体培养基中扩大培养，条件同上；约23个小时（OD值约为0.4左右）后，将菌液转移到冰预冷的50ml聚丙烯管中，冰浴10min，使细胞冷却至0；4，4100rpm，离心10min，弃上清，并尽可能吸干；用10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀；4，4100rpm，离心10min，弃尽上清；最后，用2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2 （含15%的甘油），重悬沉淀。将制备的感受态细胞分装

11、至1.5ml的微量离心管中，每管200ul。-80保存，也可以直接用于转化。大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS菌株做同样处理，制备感受态细胞。 4.感受态细胞的制备 挑取大肠杆菌JM109单菌落，接种5.转化 吸取5ul连接反应产物，加入到含200ul JM109感受态细胞的微量离心管中，轻轻旋转以混匀内容物，冰浴30min；42，热激90sec（勿摇动离心管）后，立即将管转入冰浴，使细胞冷却12min；加入800ul LB液体培养基， 37，180rpm，振摇培养1h，使菌复苏；吸取适当体积（80ul）的已转化细胞，均匀地涂布到LB固体培养基上（含卡那霉素 50ug/ml）；37，倒

12、置培养1214h。 5.转化 吸取5ul连接反应产物，加入到含200ul JM16. 菌落PCR 从5.步涂布的平板上，随即挑取数个或数十个单菌落，将其一部分进行菌落PCR，以筛选阳性克隆；对应部分转印至新的平板上（含卡那霉素 50ug/ml），37，倒置培养1216h。在10ul总反应体积中，加入ddH2O 7ul、10buffer 1ul、引物P014和P024各0.3ul（浓度为0.5 mmol/L）、甘油1ul以及Taq DNA聚合酶0.4ul（1U），进行PCR扩增。PCR程序为：95预变性5min、95变性50sec、55退火50sec、72延伸30sec、72延伸10min、4

13、forever。共25个循环。1.0琼脂糖凝胶电泳观察记录结果，筛选出阳性克隆（含重组表达质粒pET-HMW）。 6. 菌落PCR 从5.步涂布的平板上，随即挑取数个或数十个 7.重组表达质粒pET-HMW的提取 与酶切鉴定 同步骤2.小量制备重组表达质粒pET-HMW做EcoR和Sal双酶切处理，1.0琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果。 7.重组表达质粒pET-HMW的提取 与酶切鉴8.重组表达质粒pET-HMW转化 表达宿主菌 将鉴定好的重组表达质粒转化Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞，操作方法如5.所述。将适当体积的已转化细胞均匀地涂布在平板上（含卡那霉素 50ug/ml、氨卞青

14、霉素 25ug/ml），37，倒置培养1214h。 8.重组表达质粒pET-HMW转化 表达宿主菌 9.诱导表达及SDS分析 挑取含重组表达质粒pET-HMW的阳性单克隆，接种于5ml LB液体培养基中（含Kan 50ug/ml、Cm 25ug/ml），于37，180rpm振摇培养1214h；按1：100稀释加入到5ml LB液体培养基中（含Kan 50ug/ml、Cm 25ug/ml）；振摇培养至OD600值为0.5左右，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L；继续于37振摇培养45h。 12000rpm，离心30sec,收集菌体；加入1SDS loading buffer【50mM Tr

15、isCl(pH6.8)、100mM DTT、2SDS、0.1溴酚兰、10甘油】重悬沉淀；煮沸10min，12000rpm，离心5min，取上清，置于4备用。将诱导产物经SDS（凝胶配置如表1）分析，用考马斯亮蓝R250染色6h左右；然后，先用高甲醇脱色液脱色12h，再用低甲醇脱色液脱色至背景清晰为止。9.诱导表达及SDS分析 挑取含重组表达质粒pET表1 聚丙烯酰胺凝胶制备 返回表1 聚丙烯酰胺凝胶制备 返回结果与分析 （一）重组质粒pMDHMW的酶切鉴定 （二）菌落PCR （三）重组表达质粒pET-HMW的双酶切鉴定 （四）表达产物的SDS分析 结果与分析 （一）重组质粒pMDHMW的酶切鉴

16、定 （一）重组质粒pMDHMW的酶切鉴定 重组质粒pMDHMW经EcoR和Sal双酶切处理后，进行1琼脂糖凝胶电泳检测，重组质粒pMDHMW理论上应切出两条带，分别为HMW-GS14基因（长约2.2kb）以及空克隆载体pMD18（长约2.7kb）。 （一）重组质粒pMDHMW的酶切鉴定 重组质粒pMD（二）菌落PCR EcoR和Sal双酶切处理后的pET-30a(+)和回收的HMW-GS14基因进行连接。连接产物转化大肠杆菌表达宿主菌Rosetta(DE3)pLysS 后，用引物P014、P024进行菌落PCR。阳性克隆能扩增出长约400bp的片段。 （二）菌落PCR EcoR和Sal双酶切处

17、理后的pET-（三）重组表达质粒pET-HMW的双酶切鉴定 重组表达质粒pET-HMW理论上应切出两条带，分别为HMW-GS14基因（长约2.2kb）和空载体pET30a (+)（长约5.4kb）。 （三）重组表达质粒pET-HMW的双酶切鉴定 重组表达质粒p（四）表达产物的SDS分析 将重组表达载体pET-HMW转化大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS,并进行诱导表达。取15ul上样，SDS后，考马斯亮蓝R250染色结果表明：经IPTG诱导，含有重组表达质粒pET-HMW的菌株可特异地产生一条与HMW-GS14分子量相当的蛋白条带。取诱导的空载体pET30a (+)和未诱导的pET-H

18、MW做对照；小偃6号做Marker，含14亚基。 返回（四）表达产物的SDS分析 将重组表达载体pE讨 论 大肠杆菌表达宿主菌株Rosetta(DE3)pLysS是T7 RNA聚合酶/启动子表达系统。其染色体上，带有一拷贝由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因,这类菌株能配合pET载体一起表达。pLysS是带有可以与pET共存的、编码T7溶菌酶（T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的质粒。Rosetta(DE3)pLysS菌株在被诱导前，T7 RNA聚合酶的基础表达被抑制，这样可以使重组体（表达外源蛋白，可能会影响宿主细胞的生长和活力）在宿主中更稳定。 讨 论 pET系列载体是含有T7噬

19、菌体启动子的表达载体。在这类载体中，外源基因的表达是受T7噬菌体RNA聚合酶调控的，这类载体是Studier等于1990年首先构建的，后来得到很大发展。它们的典型特点就是带有pBR322的大肠菌素E1（colE1）复制区，从而赋予宿主氨卞青霉素或卡那霉素抗性。在这些载体中，编码序列在多克隆位点插入，置于天然T7RNA聚合酶启动子的控制之下。 基因在T7RNA聚合酶控制下的表达,与依赖大肠杆菌RNA聚合酶表达系统相比,有许多优越之处:首先T7RNA聚合酶合成RNA的速度数倍于大肠杆菌RNA聚合酶,并较少发生转录的终止；第二, T7RNA聚合酶只识别自己的启动序列,不能启动大肠杆菌DNA任何序列的

20、转录；最后, T7RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素(如利福平等)有抗性,可使T7RNA噬菌体启动子(PT7)控制下的基因得到充分表达。在适宜的条件下, T7RNA聚合酶/启动子系统表达的基因产物可占细胞总蛋白的25%以上，但多数情况下产量比这个比例要低得多。 pET系列载体是含有T7噬菌体启动子的表达载体。在这类载体 本研究中，HMW-GS14的表达量较低。其原因可能是：一、目的基因是真核基因，在原核表达系统中存在稀有密码子的问题，譬如密码子的偏爱性等。二、HMW-GS14分子量高达89KD，可能会对宿主细胞产生一定的毒性，影响宿主细胞的生长和活力。三、在大肠杆菌中表达外源蛋白，

21、尤其是真核蛋白时，稳定性是经常遇到的问题；本实验中表达出来的HMW-GS14，可能部分发生酶解或降解。四、培养温度对外源蛋白的表达可能也有影响：不同的蛋白对温度的要求不同，有些蛋白对温度的变化很敏感；而另外一些，温度对其的影响不大甚至没有影响。五、IPTG加入的时机（即OD值）、终浓度以及诱导时间对表达也有影响：一般要在细菌达到一定的丰度（达对数生长期或稳定期）时，进行诱导，以获得较大量的外源表达；另外，IPTG对宿主细胞有一定的毒性，所以要在不影响表达的前提下，尽量降低IPTG的浓度；还有诱导时间的问题，表达和降解达到平衡时为最佳，时间过短或过长均会使目的蛋白的量降低。不同的蛋白对这些条件的

22、要求不同，这需要在实验中具体地去摸索。 本研究中，HMW-GS14的表达量较低。其原因可能是：一 功能验证需要一定量的、较纯的HMW-GS14，所以，HMW-GS14的优化表达还需要进一步的探索。 返回 功能验证需要一定量的、较纯的HMW-GS14，所以，HMW结 论 成功构建了高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因的原核表达载体pET-HMW；HMW-GS14基因在大肠杆菌表达宿主菌Rosetta(DE3)pLysS中得到了特异表达。 结 论 成功构建了高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14参考文献 邓志英，田纪春.小麦储藏蛋白已小麦品质行状的关系及研究进展.生命科学学报.2003

23、，4（15）：233236. Y.Wan D.Wang, P.R.Shewry N.G.Halford(2002) Isolation and characerization of five novel high molecular weight subunit of glutenin genes from Triticum and Aegilops cylindrical. Theor Appl Genet 104:829839 Halford NG, Field JM, Blair H, Urwin P, Moore K, Robert L, Thompsom R, Flavell RB,

24、 Tatham AS, Shewwwry RP(1992) Analysis of HMW glutenin subunits encoded by chromosome 1A of breed wheat indicates quantitative effects on grain quality. Theor Appl Genet 83:373378 Johansson E, Svensson G(1995).Contribution of the high molecular weight glutenin subunit 21* to breadmaking quality of S

25、wedish wheats. Cereal Chem 72:287290 Studier FW(1991) Use of bacteriophage-T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J Mol Biol 219:3744 Olind.Anderson, Josephc.Kuhl, Angie Tam(1996).Construction and expression of a synthetic wheat storage protein gene. Gene 174:5158 王瑞、宁锟. 一些优质小麦及其杂种