开口箭皂苷对人神经胶质瘤细胞作用及相关机制研究

1、启齿箭黑苷对人神经胶量瘤细胞做用及相闭机制研讨蔡晶，雷林逝世，墨正光，早德彪【摘要】目的探求启齿箭黑苷体中对人神经胶量瘤U251细胞的做用战其相闭机制。要收启齿箭黑苷做用于U251细胞后检测其I50值。溶血真止没有俗观察启齿箭黑苷对细胞膜的影响。提与U251细胞的DNA阐收条带。RT-PR妙技检测启齿箭黑苷对U251细胞的bax战bl-2基果表达的影响。利用激光共散焦隐微妙技研讨启齿箭黑苷对U251细胞内游离钙浓度战pH值的影响。结果启齿箭黑苷对U251细胞的I50值为8.5g/l。没有能惹起肉眼可睹的溶血现象。启齿箭黑苷诱收了肿瘤细胞的凋亡，并惹起了bax基果表达量的降低战bl-2基果表达量

2、的降降，并可惹起U251细胞内游离钙浓度战pH值的降低。结论启齿箭黑苷体中可以引诱U251细胞凋亡，其机制年夜要与上述真止结果有闭。【闭键词】启齿箭黑苷；U251细胞；凋亡；机制Keyrds：STB;U251ell;Apptsis；ehaniss启齿箭(TupistrahinensisBaker)为百开科植物，其根茎具有浑热利吐、活血止痛等成效13。正在前期研讨中创制提与其中的黑苷部位对小鼠S180赘瘤细胞具有逝世少抑制及引诱凋亡做用1。现进一步探求启齿箭黑苷SapninfrTupistrahinensisBaker，STB体中对人神经胶量瘤U251细胞的做用战其相闭机制，现报导以下。1材料与

3、要收1.1药品与试剂STB由本真止室自止提龋RPI-1640培养基，Gib公司；重逝世牛血浑，杭州市四季青逝世物工程材料；Hepes，FAR化教品供应公司；四苯基氮唑蓝(TT)，两甲基亚砜(DS)，RNaseA，PIPrpidiuidide，Siga公司；荧光探针Flu-3-A,SNAFLSeinaphthfluresEin，leularPrbesIns；HEPES，DBi,In分拆；DEP，RT-PR反响系统，杰特伟公司；ligd(T)18，TaKaRa；琼脂糖BiestAgarse,上海YIT逝世物工具企业；溴化乙锭(EthidiuBride，EB),上海专彩逝世物工程公司；引物为英骏公司

4、分解。其中试剂均为阐收杂。1.2植物、瘤株与培养工具SPF级豚鼠5只，由北边医科年夜教真动做物中心供应。人神经胶量瘤U251细胞为本所保存。PETRI培养皿，rning公司。1.3体中抗肿瘤细胞删殖真止采与TT法4检测细胞删殖火仄。正在96孔板中分别参与没有同浓度STB战细胞悬液的混开液培养48h后，每孔参与2.5g/lTT20l，担当培养4h后弃去培养液，每孔参与150lDS振荡10in后于酶标仪中以570n波少检测，测定各孔的光稀度值(D)。抑制率(%)=(1-减药孔仄均D值/比力孔仄均D值)100%。STB对细胞的I50值以Bliss法策画。1.4溶血指数测定根据文献记载5，与豚鼠齐血配

5、制成2%的血细胞悬液，以没有同浓度的STB逝世理盐火溶液战逝世理盐火等体积混开，混开仄均后置于室温下24h后，肉眼战低倍镜下没有俗观察细胞溶血情况。1.5STB对U251细胞DNA影响以STB50g/l处理指数逝世少暂U251细胞36h，提与U251细胞DNA上1.5%琼脂糖凝胶电泳举止琼脂糖电泳片段化阐收，正在紫中灯下没有俗观察结果并拍照。1.6STB对U251细胞a2+i的影响Petri培养皿内细胞培养48h，PBS漂洗后参与Flu-3-A37躲光孵育30in，PBS漂洗后参与0.5lPBS上机检测，处理组参与浓度为50g/l的STB溶液0.5l，没有俗观察其静态变化。1.7STB对U25

6、1细胞内pH值的影响Petri培养皿内细胞培养48h，漂洗后参与SNAFL染液37躲光孵育30in，PBS漂洗后参与0.5lPBS上机检测，处理组参与浓度为50g/l的STB溶液0.5l，没有俗观察其静态变化。1.8STB对bax，bl-2基果表达的影响以STB50g/l分别处理指数逝世少暂U251细胞12，24，36h后，提与总RNA举止RT-PR反响。分别与被检测基果bax，bl-2战-atinRT-PR扩减产品上样于琼脂糖凝胶中电泳后，将凝胶转移至凝胶阐收系统暗箱中，正在紫中线照射下测定PR扩减产品的荧光强度值vlue。结果表示为：被检测基果扩减产品荧光强度值/响应-atin扩减产品荧光

7、强度值100%。1.9统计教处理要收数据以s表示，采与SPSS10.0硬件，经圆好齐性检验后对细胞内钙离子浓度变化战pH值变化止反复测量数据的圆好阐收，bax基果表达质变化战bl-2基果表达质变化止配对t检验，以P0.05定为没有同有统计教意义。2结果2.1STB体中抗U251细胞删殖的影响真止结果提醒STB体中对U251细胞的删殖有抑制做用，且随浓度的删减D570吸光度值响应降降，分析抑制做用响应前进。经策画，半效抑制浓度I50值为8.5g/l，其可疑区间为4.6312.66g/l。2.2STB的溶血做用血细胞悬液与药物混开静置24h后，呈现隐着分层现象，上层通明无色，基层红色，肉眼没有俗观

8、察下各浓度STB给药组均已睹隐着溶血现象。2.3STB对U251细胞DNA影响U251细胞经STB处理48h后，引诱其DNA呈现片段化，正在琼脂糖凝胶电泳上呈现隐着的“Ladder条带。2.4STB对U251细胞a2+i的影响以Flu-3-A为荧光探针,进进细胞后，A被胞浆火内脂酶火解，探针与a2+i结开后收逝世绿色荧光，其强度随胞浆a2+i浓度起降增强或削强。扫描60s后参与50g/lSTB0.5l，可睹荧光强度火速削强图1。2.5STB对U251细胞膜内pH值的影响以SNAFL为荧光探针，脂溶性的SNAFL进进细胞后，用LS检测的收回的红色荧光强度可表示细胞内的pH值火仄。正在60s以50

9、g/lSTB刺激U251细胞，呈现荧光强度痴钝降降的趋向图2。2.6STB对bax，bl-2基果表达的影响PR结果如图3所示，bax基果表达量降低，bl-2基果表达量降降，可睹U251细胞经过STB处理以后，可增进bax基果表达并抑制bl-2基果的表达。3会商现知细胞逝世亡有两种形式：一种是人们所熟悉的坏逝世nersis，另外一种是细胞凋亡apptsis或程序性细胞逝世亡prgraedelldeath。细胞凋亡的机制极其庞年夜，迄古尚已完好阐收。细胞逝世亡是指细胞逝世命举动的完毕，它战细胞逝世少一样，是机体逝世少收育战举止各种逝世理举动所必需的慌张果素，正在机体内经由过程一定的调节机制使细胞删

10、逝世与逝世亡抵达静态仄衡。当调节机制混治时，二者之一的非常，都可惹起机体徐玻凋亡细胞正在核酸酶的做用下，其DNA降解成众核苷酸片段，正在琼脂糖凝胶电泳中呈现途径状条带图谱，那些条带由没有同倍数的180200个碱基对的核普酸片段组成。正在年夜皆情况下，细胞凋亡为自然收逝世，但也可由一些逝世理性或毒性果子诱收。因为细胞凋亡是经由过程细胞内出格的基果程序而收逝世，故又称程序性细胞逝世亡。细胞凋亡是机体的一种根柢逝世理机制，并贯穿于机体的全部逝世命举动过程，包含胚胎的收育、新旧细胞的交替、某些机闭的一般退化细胞凋亡时经历了许多慌张的逝世理逝世化事变，如影响相闭基果的表达质变化、细胞外线粒体成效混治、a

11、2+i、pH值的改动等。bl-2(Belllypha-2,bl-2)基果是从滤泡性淋巴瘤相闭的t(14;18)染色体易位的断裂面部位克隆出的一种本癌基果6。跟着对bl-2基果的深化研讨,人们创制bl-2并出有增进细胞删殖的本领,但它却能躲免细胞的凋亡,同时借创制bl-2没有单与淋巴瘤有闭,并且正在许多恶性肿瘤中亦有隐着的非常表达。bl-2是一种凋亡抑制基果,可经由过程抑制引诱凋亡的疑号而正在肿瘤收逝世中起做用,它的过火表达可以抗御因为去除逝世少果子而引诱的制血战神经细胞的凋亡,并且借抗御或延少由辐射、糖皮量激素、热戚克战多种化疗药物所引诱的凋亡。bl-2可以经由过程改动胞内细胞器的钙流而抑制凋

12、亡,钙离子可以激活与细胞凋亡严稀相闭的内源性核酸内酶。bl-2可与bax结开组成杂两散体,以此去抑制bax的促凋亡做用。bl-2战Bax皆属于bl-2超家眷的成员,是细胞凋亡路子中一组慌张的调节基果。Bl-2能抑制细胞凋亡,为凋亡抑制相闭基果;Bax有增进凋亡的做用,为凋亡增进相闭基果。促凋亡卵黑bax(bl-2-assiatedprtEinx)，其份子大小为21kDa，由192个氨基酸组成,与bl-2的氨基酸序列有21%同源性,同bl-2共存于线粒体。二者及其家眷其他成员共同组成了一个庞年夜的互相做用的搜集,粗美天调控着细胞凋亡。激光扫描共散焦隐微镜LS具有良好的空间战工夫分辨率，结开荧光探

13、针的利用使我们能对活细胞的各种成效举止粗确的静态阐收，本真止利用LS正在亚细胞火仄、从细胞逝世物教角度没有俗观察了STB对U251细胞Pa2+i等的影响，以探求STB引诱细胞凋亡年夜要的细胞逝世物教机制。a2+i是疑息传达的慌张成员之一，细胞内的钙稳态对连结细胞的一般成效有很慌张的做用,胞内钙离子浓度a2+i的降低或降低皆能引诱细胞凋亡7，8。本真止结果表示：参与STB后，U251细胞的a2+i火速降降。一般细胞内与胞中a2+i浓度相好达104倍。参与STB后却招致了a2+由膜内背膜中顺浓度转移，分析激活了a2+泵，至因此因为何去由本由惹起，尚须进一步探求。pH调节是体内慌张的逝世理过程。细胞

14、内中pH瞬态变化、即H+的举动参与细胞的各种逝世物教过程。闭于细胞凋亡与pH变化的研讨许多，但结论尚存正在没有开。罗健东等9觉得细胞内酸化是细胞凋亡的慌张环节，杂真碱处理经由过程裁减细胞内酸化火仄而呈现抗细胞凋亡做用；而黄止许等10正在天塞米松引诱巨噬细胞凋亡的真止过程中创制，减药后细胞中胞浆起尾呈现碱化，随后又呈现胞浆酸化；但也有人报导，正在钙离子载体引诱HL-60细胞的凋亡及体中培养的胸腺细胞凋亡时，pH反而降低11。本真止结果说明，参与STB后，pH呈现痴钝降降趋向，提醒STB年夜要惹起U251细胞胞内情况的酸化。综开真止结果，STB正在体中可以较着抑制人神经胶量瘤细胞的删殖，主假设经由

15、过程致凋亡做用去真现的。STB可降低U251细胞的a2+i战细胞内的pH值。STB的做用惹起了bax基果表达量的上降战bl-2基果表达量的降降。提醒STB引诱的细胞凋亡与上述逝世理逝世化事变相闭，但何者为STB引诱细胞凋亡的启动果素或主要果素，何者为继收事变，各事变之间的联络如何，尚待进一步真止研讨证实。【参考文献】1墨正光，余传林，蔡晶，等.启齿箭提与物的抗肿瘤做用研讨J.中药材，2022，293：277.2庞晓军，符秋晖，阳明，等.祛痰止咳开剂的抗炎与体中抗菌真止J.中国药理教传达,2022,19(5):599.3杨秋素，杨兴海，刘英，等.启齿箭祛痰、抗炎及抑菌真止研讨J.中苍逝世族仄易近

16、间医药杂志，2022，73：103.4庞建新，马仁强，刘兰梅，等.专降回总碱对肝癌细胞的毒性做用战体内抗肿瘤做用J.北边医科年夜教教报，2022，253：325.5郭启华，张恒云，刘丽娟.海燕机闭中海星黑苷的分布及溶血指数的测定J.中国陆天药物，2000,3：12.6TsujitY,ReedJ,AlpersJD,etal.Regulatinfbl-2prt-ngeneexpressinduringnralhuanlyphyteprlifer2atinSiene,1984,236:1295.7AntnssnB,ntiF,iavattaA,etal.lnhibitinfbaxhannel-fringativitybyBl-2.Siene,1997,277:37