基因工程 1.2课件

1、目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。1.2 基因工程的基本操作程序第一步：获取目的基因（1）方法：从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因人工合成目的基因注:目的基因：指编码蛋白质的结构基因，也有调控因子。外显子内含子原核生物基因结构 附编码区:可转录为信使RNA进而指导蛋白质合成非编码区：有调控遗传信息表达的核苷酸序列非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点(启动子)编码区终止子真核生物基因结构外显子内含子非编码区：有调控遗传信息表达的核苷酸序列编码区:外显子可转录为mRNA进而指导蛋白质合成，内含子产生的mRNA最终切去，不指导蛋白质的

2、合成与RNA聚合酶结合位点(启动子)编码区非编码区非编码区终止子从基因文库中获取目的基因基因组文库：受体菌群体包含一种生物的所有基因。部分基因文库：包含一种生物的部分基因 （如cDNA文库）。基因文库： 将某生物的DNA片段导入受体菌的群体中储存，各受体菌分别含该生物的不同基因。受体菌群体某生物体内全部DNA 限制酶许多DNA片段与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNA反转录受体菌群体cDNA与运载体连接导入（cDNA文库）基因文库的构建基因组文库与cDNA文库的区别学生自学P10变性复性延伸加热到90-95 ，DNA双链解旋为单链降到55-60 ，引物通过碱基互补配对与单链DNA

3、结合升温到70 -75，四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,82430次循环后目的基因扩增的数量基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端基因表达载体模式 目的基因启动子：终止子：标记基因：复制原点:一段特殊结构的DNA片段，位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，开始转录位于基因尾端，终止转录。鉴别受体细胞中是否含有目的基因，以便筛选。（2）基因表达载体的组成：P11注：启动子（终止子）

4、是否转录出起始（终止）密码子？复制原点+启动子+目的基因+终止子+标志基因基因表达载体的组成花粉管通道法导入动物细胞：显微注射技术 导入微生物细胞：程序:提纯表达载体,浓度在1-3ug/mL; 注射受精卵； 移植发育原核生物的特点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质少（常用大肠杆菌） 用 处理，增加细菌细胞壁的通透性， 使之能吸收周围DNA，称 ； 在缓冲液中完成转化。注：细菌的细胞壁成分？主要是肽聚糖Ca2感受态细胞转化过程：第四步：目的基因的检测与鉴定（成功）（1）检测内容： （2）对应技术：DNA分子杂交技术DNA与DNA杂交分子杂交技术DNA与RNA杂交蛋白质分子（抗原抗体）间杂交探针：将含

5、目的基因的片段用放射性同位素标记。其他：个体生物学水平鉴定 目的基因是否插入受体细胞的DNA上（关键） 是否转录出了mRNA 是否翻译成蛋白质目的基因的检测示意图 1.目的基因的获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成复制原点 +启动子+目的基因 + 终止子 + 标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca2+处理法DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定小结1.人们常选用的细菌质粒分子往往带有抗生素抗性基因,该抗性基因的主要作用

6、是 ( )A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入进行检测C.增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接B练 习2.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的,在基因操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成目的基因B.目的基因与载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达C3.1976年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了表达,此文中的表达是指该基因在大肠杆菌 ( )A.能进行DNA复制B.能传递给细菌后代C.能合成生长抑制素释放因子D.能合成人的生长素C6多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DN

7、A片段的技术。PCR过程一般经历下述循环：95下使模板DNA变性、解链55下复性（引物与DNA模板链结合）72下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是（ ）A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高 C 7.下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图(箭头表示剪切点、切出的断面为黏性末端)。下列叙述正确的是 A限制酶2和4识别的序列都包含4个碱基对B限制酶3

8、和5识别的序列都包含5个碱基对C限制酶l和2剪出的黏性末端相同D限制酶1和3剪出的黏性末端相同 D8.下图中表示一项重要生物技术的关键步骤，字母X最可能代表A不能合成胰岛素的细菌细胞 B能合成抗体的细菌细胞C能合成胰岛素的细菌细胞 D不能合成抗生素的细菌细胞 C 9、限制性内切酶能识别特定的DNA序列并进行剪切，不同的限制性内切酶可以对不同的核酸序列进行剪切。现以3种不同的限制性内切酶对6.2kb大小的线状DNA进行剪切后。用凝胶电泳分离各核酸片断，实验结果如图所示。请问：3种不同的限制性内切酶在此DNA片断上相应切点的位置是（ ） D10.图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切

9、酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR 为四环素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答：（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRI酶切，酶切产物用连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 三种 。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。目的基因载体连接物 载体载体连接物 目的基因目的基因连接物 分离纯化 载体载体连接物 载体载体连接物 （2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种

10、到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 ；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 目的基因载体连接物 （4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是 。EcoRI、BamHI(3)目的基因表达时,RNA聚合酶识别和结合的位点是 。其合成的产物是 启动子mRNA T1234512345 A磷酸二酯键下表为几种限制性核酸内切 酶识别的序列和切割的位点。如下图，已知某DNA在目的基因的两端1、2、3、4四处有BamHI或EcoRI或PstI的酶切位点。现有BamHI和EcoRI两种酶同时切割该DN

11、A片段（假设所用的酶均可将识别位点完全切开），下列各种酶切位点情况中，可以防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状的是（ ）A 1为BamHI，2为EcoRI，3为BamHI，4为PstIB 1为EcoRI，2为BamHI，3为BamHI，4为PstIC 1为PstI，2为EcoRI，3为EcoRI，4为BamHID 1为BamHI，2为EcoRI，3为PstI，4为EcoRI3 将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。植物疫苗制备过程相关图表如下。耐高温引物对B请据图表回答下列问题。（1）常规PCR扩增目的基因时，使用的DNA聚合酶不同于一

12、般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 （2）PCR过程中复性温度是根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为两对引物序列。判断哪一对引物可采用较高的退火温度？_。（3）图1步骤所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？ 。（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤转基因所用的细菌B通常为 。否农杆菌21（5）酶切重组质粒T，假设所用酶均可将识别位点完全切开，据图1标示的酶切位点和表2的识别序列，对以下酶切结果作出判断。采用EcoR和Pst酶切，得到_种DNA片段。采用EcoR和Sma酶切，得到_种DNA片段。2126. 解析：PCR技术扩增DNA时，首先要在80100的温度

13、范围内使DNA解螺旋。高温解决了打开DNA双链问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。20世纪80年代，科学家从水生耐热细菌Taq中分离得到耐高温的TaqDNA聚合酶，使体外DNA扩增成为现实。碱基A与T之间是依靠两个氢键相连配对，碱基C与G之间是通过3个氢键相连配对，DNA分子中碱基C与G的比例决定了DNA分子的耐高温的程度。引物对B中C与G的比例明显高于引物对A，因此，引物对B可采用较高的退火温度。DNA连接酶的作用部位是磷酸基团与五碳糖之间的磷酸二酯键，自然，对所连接的DNA两端的碱基没有专一性要求。将外源基因导入不同受体细胞时，所用的方法是不同的。对于动物细胞常用显微注射法，对于植物细胞最常用的是农杆菌转化法。故本小题所用的细菌B通常为农杆菌。由图1-过程知，用EcoR酶和Alu酶切割抗原基因DNA片段会得到XY片段，由图1-过程可知，用