果蔬成分生化分析

1、果蔬成分生化分析摘要：果蔬中营养成分多种多样，本实验以黄豆芽和绿豆芽为研究对象，对其主要营养成分（维生素C含量、总糖及还原糖含量、蛋白质含量）测定与其过氧化物酶分析都运用了比色法，并对测得数据列图表，进行对比研究。结果表明：黄豆中的主要营养成分相对于绿豆芽含量高，但其过氧化物酶活性低于绿豆芽，这说明其酚类物质代谢能力低于绿豆芽。总的来说，黄豆芽和绿豆芽营养价值都不高，但黄豆芽相对于绿豆芽营养成分较高。关键词：黄豆芽；绿豆芽；维生素；总糖及还原糖；蛋白质；过氧化酶Biochemical analysis of fruit and vegetable ingredientsCollege of l

2、ife and Environmental Sciences， Class of 11 biological scienceZhang FengpingAbstract: Fruit and vegetable nutrition in variety, this experiment with bean sprouts and mung bean as the research object, the main nutrients (vitamin C content, total sugar and reducing sugar content, protein content and p

3、eroxidase isoenzyme analysis) determination by colorimetry, and the measured data column chart, carries on the contrast research.The results show that: the soybean main nutrition component relative to the high content of mung bean sprout, but its peroxidase activity below the mung bean sprouts, whic

4、h explains its phenolic metabolism than mung bean sprouts.In general, yellow bean sprouts and mung bean sprouts nutritional value is not high, but the yellow bean sprouts and mung bean sprouts nutrients relative to higher.Keyword：Yellow bean sprouts; mung bean; vitamin; total sugar and reducing suga

5、r protein; peroxidase前言 随着人们生活水平的提高，人们对食物的营养也更加关注，蔬菜成了大家日常饮食中必不可少的食物之一。蔬菜可提供人体所必需的多种维生素和矿物质。豆芽也是营养价值较高的食物，被称为“活体蔬菜”。目前市场上主要的豆芽是黄豆芽和绿豆芽两大类。 黄豆蛋白质含量虽高，但由于它存在胰蛋白酶抑制剂，使它的营养价值受到限制，所以人们提倡食用豆制品。近年发现豆芽中含有一种干扰素生剂，能诱生干扰素，增加体内抗生素，增加体内抗病毒、抗癌肿的能力。另外，中意认为绿豆芽性凉、味甘无毒，能清暑热、调五脏、解诸毒、利尿除湿，可用于过度饮酒、湿热郁滞、食少体倦等。日本科学家还发现，在绿

6、豆芽的发芽过程中，部分蛋白质可分解为氨基酸，从而增加原有的氨基酸含量。其中还含有纤维素，若与韭菜同抄或凉拌，用于老年及幼儿便秘，健全又有良效。因此，本次试验我们把豆芽作为研究对象，对其主要营养成分（维生素C、蛋白质、总糖、还原糖）进行分析，以此能够得出豆芽对人体有哪些重要作用，并能很好地加以利用。并且更加深入的了解实验的原理及所需的实验方法和技巧。2实验内容及结果实验一 果蔬中维生素C的定量测定（1）实验原理：2，6-二氯酚靛酚滴定法氧化型染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。成为还原型后为无色。用氧化型染料来滴定还原型维生素C，当滴至全部还原型维生素C被氧化后，在稍滴一点呈微红色

7、为终点。滴定用去染料量与样品中还原型维生素C量成正比。（2）实验仪器及试剂：微量滴定管及架，漏斗，滤纸，100ml锥形瓶2个，50ml量筒1个，台秤，移液管若干，1%草酸溶液，2%草酸溶液，维生素C标准液，氧化型0.1%2,6-二氯酚靛酚溶液（染料）（3）实验步骤： a、制备新鲜果蔬液：挑选豆芽，剔除烂根部分 称20.0g左右于研钵中 加2%草酸定容静置10min、过滤 40ml豆芽提取液b、滴定维生素C标准液： 将染料液装入滴定管，驱赶气泡，调整零点 锥形瓶滴定中加1.0ml维生素标准溶液和9ml1%草酸溶液 溶液微红色，15s不褪色（记下染料液未滴前滴定管的读数和滴定后的读数）c、滴定样品

8、液 吸取3份10.0ml样品液放入锥形瓶中，同上操作，并记录相应读数。取平均数。（4）实验结果：滴定1%维生素标准液消耗染料：1.14ml，由此可算得1ml染料相当于0.088mg维生素，即c=0.088mg滴定黄豆芽消耗染料：V1= 1.50mlCV1 W滴定绿豆芽消耗染料：V2=2.43mlCV2W每100g黄豆芽中维生素C含量：m= 100=2.64g每100g绿豆芽中维生素C含量：m= 100=4.28g实验二 果蔬中总糖及还原糖含量的测定（1）实验原理：蒽酮比色法 单糖类遇到浓硫酸时，脱水生成糠醛衍生物，后者可与蒽酮缩合成蓝绿色的化合物，当糖的量在20-200mg范围内时，其呈色强度

9、与溶液中糖的含量成正比，故可比色定量。（2）实验仪器及试剂：分光光度计，水浴锅，电子分析天平，电炉，100ml容量瓶1个，试管10支，玻璃漏斗，研钵，移液枪，量筒和三角烧瓶若干，蒽酮试剂，标准葡萄糖溶液，6mol/LHCl溶液，20%NaOH溶液（3）实验步骤：a、葡萄糖标准曲线的绘制：取洁净试管6支，按表1进行操作：表1 蒽酮比色法定糖标准曲线的制作以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/ml）为横坐标做图得标准曲线。b、样品中还原糖的提取和测定研磨 50水浴称1g豆芽+水3ml(于研钵) 匀浆 全部转入三角烧瓶包括冲洗液冷却 过滤 低温 保温约0.5h取浸出的还原糖 定容至100ml 滤液

10、取10ml 稀释冰浴中冷却 沸水浴10min至100ml 取1ml终液 加入4ml蒽酮试剂 冷却620nm处比色 读取吸光值 从标准曲线中查询读取还原糖浓度。3、样品中总糖的提取、水解和测定称1g豆芽+水3ml(于研钵) 研磨 匀浆 全部转入三角烧瓶（包括冲洗液） 加入溶液6mol/L盐酸10ml 搅拌 沸水浴0.5h 冷却 加入20%过滤 低温保存NaOH溶液至中性 定容至100ml 滤液 取滤液10ml稀释至100ml 取1mL终液同上法进行还原糖测定。（4）实验结果：黄豆芽绿豆芽还原糖OD值0.1500.182总糖OD值0.1330.297 由标准曲线得，测还原糖时C1（黄豆芽）=0.0

11、21mg/ml；C2（绿豆芽）=0.025mg/ml 测总糖时C3（黄豆芽）=0.019mg/ml；C4（绿豆芽）=0.041mg/ml则W1=C1V/m100%=2.1%; W2=C2V/m100%=2.55%; W3=C3V/m100%=1.67%； W4=C4V/m100%=3.69%实验三 果蔬中蛋白质含量测定（1）实验原理：考马斯亮蓝法蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质

12、含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。（2）实验仪器及试剂：分光光度计，离心机，试管8支，其余器材同上，标准蛋白质溶液，考马斯亮兰G-250染料试剂，0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8）（3）实验步骤：a、标准曲线绘制取6支试管，按下表加入各试剂。 管号 试剂012345100g/ml牛血清白蛋白溶液mL00.20.40.60.81.0蒸馏水mL1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝液mL5.05.05.05.05.05.0加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。以各管相应标准蛋白

13、质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。b、样品制备研磨 全部转入离心管1g新鲜豆芽置于冰浴上的研钵内+1ml水 匀浆 3500rpm高速离离心15-20min 心 取上层清液为自制蛋白质样品，备用c、样品测定自制蛋白质样品1.0mL+5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂 摇匀放置5min 595nm波长下比色 读取吸光度，并记录 从标准曲线中查询读取蛋白质含量（4）实验结果：黄豆芽绿豆芽OD值0.2940.153由标准曲线得，m（绿豆芽）=27.45=137g m（黄豆芽）=52.95=264.5g实验四 果蔬中过氧化物酶分析（一）过氧化物同工酶的分离（1）实验原理：聚丙烯酰胺

14、凝胶电泳凝胶电泳具有一般电泳的电场效应，即在一定pH的溶液中，样品分子由于解离或吸附，使自身带一定的电量，在相同的电场强度作用下，不同的样品分子因带不同的电性和电量，电泳时具有不同的泳动速度，使最终的迁移距离不同而分离。凝胶电泳与其他电泳的重要区别是它除了有电场效应外，还具有分子筛效应，因凝胶是一种立体网状结构的物质，样品分子在通过凝胶网孔时受摩擦力等的作用，使体积小、形状为圆球形的样品分子受到的阻力小，移动较快，而体积大，形状不规则的样品分子受阻力大，移动较慢。因此，凝胶电泳不但从分子带电情况的差别，而且还从分子大小、形状方面的差别来分离样品分子，具有很高的分辨力。（2）实验仪器及试剂：垂直

15、板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线管），直流稳压稳流电泳仪，移液枪，高速离心机，大培养皿，量筒和烧杯若干，A（分离胶缓冲液），B（浓缩胶缓冲液），C（分离胶贮液），D（浓缩胶贮液），E 核黄素，F 蔗糖，电极缓冲液(用时稀释10倍)，封板胶（加热煮沸），样品提取液（0.1 mol/L磷酸盐缓冲液pH7.6），染色液，前沿指示剂（3）实验步骤：贮液配制（实验室提供）b、电泳槽安装去污直立干燥 两块玻璃板 装入硅胶条中，垂直固定在电泳槽上（按对角线顺序旋紧螺丝）周边用1.5的琼脂密封 安装完毕凝胶制备（A、B、C、D、E、F分别代表的溶液可从试剂2.2中得知）按下表配置分离胶A3mlC6m

16、l0.14%过硫酸铵12ml水3mlTEMED15l（分离胶沿玻板加入胶室内，避免气泡产生，加至距短玻璃板顶端3cm处，立即覆盖2-3mm水层，静置待胶与水层的界面重新出现时，表明胶已经聚合）按下表配置浓缩胶B1.5mlD3mlE1.5mlF6mlTEMED18l（TEMED在灌胶前加，或灌胶后都得放在黑暗环境中。倒掉分离胶水层 吸水纸吸干 立即加浓缩胶，插入梳子 凝胶后 取梳子，稀释十倍的点击缓冲液倒入槽中：短板侧缓冲液没过样品槽，长板缓冲液没过电极。备用。）样品制备取40l样液和8l上级缓冲液混合，留作点样用。点样用微量注射器（50l）吸取少量样液，在浓缩胶上层点样，每个点样槽15-50l

17、。电泳接好电源线（前槽为负极）。电源打开，调节电流到20mA左右，样品进入到分离胶后染色、记录结果加大到30mA，维持恒流。待指示染料下行到距胶板末端1cm处，电泳结束。关闭电源，该过程大约2小时。剥胶取电泳胶板，去胶套，掀开玻璃，去浓缩胶，放入培养皿。染色、记录结果把配置好的染色液倒入培养皿，室温下1-10min左右后显示蓝色条带，后变红褐色。用去离子水漂洗，并拍照记录。(4) 实验结果：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果黄豆芽：同工酶移动距离cm1.101.152.653.104.104.35移动率0.1830.1920.4420.5170.6830.725移动终点：6.00cm绿豆芽：同工酶移动距离

18、cm1.051.201.651.952.704.45移动率0.1690.1940.2660.3150.4350.718移动终点：6.20cm(二) 过氧化物酶活性的测定（1）实验原理：比色法 化氢存在下，过氧化氢酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm的吸光度变化测定过氧化氢酶活性。（2）实验仪器及试剂：分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100ml容量瓶，离心机，比色皿若干，0.1mol /L 磷酸缓冲液pH7.6，反应混合液（实验室已配制）（3）实验步骤：a、把上次蛋白质含量测定试验中制得的贮液从冰箱中拿出做为该次实验的材料b、 一只加反应

19、混合液3ml+磷酸缓冲液1ml 取光径1cm比色杯3只 一只加反应混合液3ml+磷酸缓冲液1ml+黄豆芽酶液1ml 一只加反应混合液3ml+磷酸缓冲液1ml+绿豆芽酶液1ml分光光度计测量波长470nm下吸光值 连续5min，取平均值开启秒表，每隔1min读一次（4）实验结果：01min2min3min4min5min对照组0.0000.0000.0000.0000.0000.000黄豆芽3.3653.2923.2013.1043.1203.181绿豆芽1.1182.7663.0943.0933.0773.143OD470nm 0.01t黄豆芽OD470nm=0.068过氧化物酶活力 = D=

20、6.80OD470nm 0.01wt过氧化物酶比活力 = D=6.80 u/（gmin）OD470nm0.01t绿豆芽OD470nm=0.412过氧化物酶活力 = D =41.20OD470nm 0.01wt 过氧化物酶比活力 = D =41.20 u/（gmin）3.实验分析及讨论实验结果中黄豆芽和绿豆芽的维生素含量都不是很高，可能是实验过程中有不当之处。测定过程采用的是用氧化型2，6-二氯酚靛酚氧化滴定维生素C，滴定用去氧化型2，6-二氯酚靛酚与样品中还原型维生素C量成正比。而还原型维生素C又易被空气中的氧气所氧化，由于该实验在苹果研磨时花费时间较大，导致大部分还原型维生素C在滴定前就被氧气氧化，滴定所用的氧化型2，6-二氯酚靛酚减少，因此所测得样品中维生素C含量不高。正常情况下，黄豆芽中维生素C的含量应高于绿豆芽，但在本次实验中结果恰好相反，可能的原因是a 黄豆芽的豆瓣较大，研磨时难以研磨成匀浆，使豆瓣中的大量维生素C没有完全进入样品液中；b 在转