【课件】第四章RQ补料发酵终点7版

1、【课件】第四章RQ补料发酵终点7版【课件】第四章RQ补料发酵终点7版 第六节 二氧化碳和呼吸商 1. 二氧化碳对发酵的影响二氧化碳是细胞代谢的可贵指示。通过碳质量平衡来估算生长速率和细胞量。二氧化碳对氨基酸、抗生素等微生物发酵具有抑制或刺激作用。 A 二氧化碳对菌体生长及产物形成的影响当排出的二氧化碳CO2浓度高于4%时，碳水化合物的代谢及微生物的呼吸速率下降。当二氧化碳分压为0.08105Pa时，青霉素合成速率会降低40%。发酵液中溶解二氧化碳浓度为1.6102mol时，会严重抑制酵母菌的生长。 第六节 二氧化碳和呼吸商【课件】第四章RQ补料发酵终点7版当二氧化碳分压为0.0042105Pa

2、时，四环素的生物合成处于最佳状态。 CO2会影响产黄青霉菌的形态 当二氧化碳分压为0.0042105Pa时，四环素的生物合成二氧化碳及HCO3都会影响细胞膜的结构。它们分别作用于细胞膜的不同位点。 溶解于培养液中的二氧化碳主要作用在细胞膜的脂肪酸核心部位， 而HCO3则影响磷脂、亲水头部带电荷表面及细胞膜表面上的蛋白质。 当细胞膜的脂质相中二氧化碳浓度达一临界值时，使膜的流动性及表面电荷密度发生变化，这将导致许多基质的膜运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，细胞生长受到抑制，形态发生了改变。二氧化碳及HCO3都会影响细胞膜的结构。它们分别作用于细胞10米高的罐中，在1.01

3、105Pa气压下操作，底部二氧化碳分压是顶部二氧化碳分压的二倍。10米高的罐中，在1.01105Pa气压下操作，底部二氧化B 排气二氧化碳浓度与菌体量、pH、排气氧之间的关系 a 检测菌体生长菌体生长速率与二氧化碳释放率(CER)成比例关系。菌量产率YX/CO2为30.2ggCO2.B 排气二氧化碳浓度与菌体量、pH、排气氧之间的关系从测定排气二氧化碳浓度变化，采用控制流加基质的方法来实现对菌体的生长速率和菌体量的控制。从测定排气二氧化碳浓度变化，采用控制流加基质的方法来实现对菌b 补糖与排气二氧化碳、pH变化关系在青霉素发酵中补糖将引起排气二氧化碳浓度的增加和培养液pH下降见图933。所产生

4、的二氧化碳可以用青霉素产生菌的生长和产物形成的化学简式来说明，见式(9-26)，式(9-27)，式(9-28)。可见，随着糖耗的增加，CER也增加。 菌体生长 C6H12O6十NH3十3.3O2十0.06H2SO4 0.42C71H13.2O4.4NS0.06十3CO2十4.8H2O (9-26) 菌体维持 C6H12O6十6O2 6CO2十6 H2O (9-27) 青霉素生产 C6H12O6十(NH4)2SO4十0.5O2 十PAA C16H17O4N2S十2CO2十H2O (9-28) b 补糖与排气二氧化碳、pH变化关系 从图933中看出，由于葡萄糖的补入，排气二氧化碳增加，同时pH下降

5、。其原因主要有两个方面，一是葡萄糖被菌利用产生二氧化碳，溶于培养液使pH下降二是葡萄糖被菌利用过程产有机酸，使pH下降。糖、CO2、pH三者的相关性，被青霉素工业生产上用于补料控制的参数，并认为排气二氧化碳的变化比pH变化更为敏感；所以以测定排气CO2释放率来控制补糖速率。从图933中看出，由于葡萄糖的补入，排气二氧化碳增加，同时C 排气二氧化碳浓度和排气氧浓度的相关性 由式(9-26)一式(9-28)可知，菌体耗糖形成二氧化碳时，必须提供作为生物氧化所需 氧，因此在排气成分分析中，可以很明显得到氧浓度降低和二氧化碳浓度升高的对应曲线，其相关深度可用呼吸商RQ来表示。 C 排气二氧化碳浓度和排

6、气氧浓度的相关性2. 呼吸商与发酵的关系发酵过程中菌的耗氧速率(OUR)可通过热磁氧分析仪或质谱仪测量进气和排氧中的氧含量计算而得， 过程中氧含量的变化恰与二氧化碳含量变化成反向同步关系，并由此看出菌的生长，呼吸情况，和求出菌的呼吸商RQ值， RQCEROUR。 RQ可以反映菌的代谢情况。2. 呼吸商与发酵的关系如酵母发酵过程RQ1，表示糖代谢走有氧分解代谢途径，仅生成菌体，无产物形成；如RQ1.l，表示走EMP途径，生成乙醇；RQ0.93，生成柠檬酸；RQ0.7，表示生成的乙醇被当作基质利用。 菌在利用不同基质时，RQ值也不相同。如大肠杆菌以延胡索酸为基质，RQ为1.44；丙酮酸RQ为1.2

7、6，琥珀酸RQ为1.12；乳酸、葡萄糖RQ为1.02和1.00；乙酸 RQ为0.967甘油RQ为0.80。 如酵母发酵过程RQ1，表示糖代谢走有氧分解代谢途径，仅生成在抗生素发酵中，由于存在菌体生长、维持以及产物形成的不同阶段，其RQ值也不一样。如青霉素发酵中的理论呼吸商为 菌体生长，RQ0.909； 菌体维持，RQ1； 青霉素生产，RQ4。 在抗生素发酵中，由于存在菌体生长、维持以及产物形成的不同阶段从上述情况来看，在发酵早期主要是菌体生长，RQ低于1；在过渡时期，由于菌体维持其生命活动及青霉素逐渐形成，基质葡萄糖的代谢不是仅用于生长菌体，(如式9- 27)此时RQ比生长期略有增加；产物形成

8、时RQ达最高；产物形成对RQ的影响较为明显。如果产物的还原性比基质大时，其RQ值就增加；反之，当产物的氧化性比基质大时，RQ值就要减少。其偏离程度决定于每单位菌体利用基质所形成的产物量。从上述情况来看，在发酵早期主要是菌体生长，RQ低于1；二氧化碳和呼吸商复习题1,二氧化碳对发酵有何影响2,二氧化碳影响细胞的什么部位,使细胞处于什么状态.3,排气二氧化碳浓度与菌体量、pH、排气氧之间有什么关系.4,什么叫呼吸商,呼吸商如何反映代谢情况.二氧化碳和呼吸商复习题1,二氧化碳对发酵有何影响 第八节 基质浓度对发酵的影响及补料控制 1. 基质浓度对发酵的影响 在分批发酵期间，有一种与Iangmur单分

9、子吸附等温线相似的模型，用以描述基质浓度与生长速率的关系，称为monod模型，见式(9-30) (930)。 式中 比生长速率h1 最大比生长速率； S基质浓度； Ks饱和常数，是在0.5时的基质浓度。 第八节 基质浓度对发酵的影响及补料控制【课件】第四章RQ补料发酵终点7版a.底物的反馈抑制作用 由以上线段C可知当底物浓度较高时就会产生底物的反馈抑制作用,随着底物浓度的增加,比生长速率反而下降.b.细胞脱水作用葡萄糖浓度低于100150gL，不会出现生长的抑制，但当浓度超过350600gL时，多数生物不能生长，在这种浓度下会使细胞脱水。只有嗜渗性的生物能在这样高浓度的溶液中生长。 a.底物的

10、反馈抑制作用c.高浓度基质会引起碳分解代谢物阻遏现象阻碍了产物的形成。例如，在葡萄糖氧化酶(GOD)发酵中，以葡萄糖为碳源，它对GOD的形成具有双重效应，即低浓度下有诱导作用而高浓度下有分解代谢物阻遏作用。试验结果表明葡萄糖的代谢中间物，如柠檬酸三钠、琥珀酸钠、苹果酸钙和丙酮酸钠，对GOD的形成有明显的抑制作用。因此，降低葡萄糖用量，从8%降至6%，补入2%氨基乙酸或甘油，使酶活力分别提高26%或6.7%，能部分解除由高浓度葡萄糖所产生的分解代谢物的阻遏作用。c.高浓度基质会引起碳分解代谢物阻遏现象2. 补料控制 解除基质过浓的抑制 产物的反馈抑制 和葡萄糖分解阻遏效应 避免在分批发酵中因一次

11、性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多而供氧不足的状况 近年来从补料方式到计算机最优化控制等都取得较大进展。就补料方式而言，有连续流加和变速流加。每次流加又可分为2. 补料控制 快速流加、 恒速流加、 指数速率流加 变速流加。 从补加的培养基成分来区分，又可分成 单一组分补料和 多组分补料等等。蠕动泵 蠕动泵选择恰当的反馈控制参数进行中间补料了解这些参数对于微生物代谢、菌体生长、基质利用以及产物形成之间的关系。补料程序依赖于比生长曲线、菌体形态、产物生成速率及发酵的初始条件等的情况。选择恰当的反馈控制参数进行中间补料反馈控制操作非直接方法 以溶氧、pH、呼吸商、排气中二氧化碳分压及代谢物质浓度等

12、作为反馈控制参数。直接方法 直接以限制性营养物浓度作为反馈控制参数，例如 控制氮源、碳源或碳、氮比等方式。目前只有少数基质，如甲醇、乙醇、葡萄糖能直接测量。由于缺乏能直接测量重要参数的传感器，因此直接方法的使用受到了限制。反馈控制操作建立分批补料培养的数学模型及选择最佳控制程序在谷氨酸发酵过程中，生产菌的摄氧率和基质消耗速率之间在生长某一阶段存在着线性关系。根据这种关系，补料的联机控制可通过摄氧率来执行。可将补料速率控制在与基质利用速率相等的状态。测出分批加糖过程中排气氧浓度，计算摄氧率(OUR)，与糖耗速率(qsX)之间的线性关系式如下：建立分批补料培养的数学模型及选择最佳控制程序在谷氨酸发

13、酵过程(931) 利用K值和摄氧率可间接估算糖耗。从理论上按反应式(9-31)计算可得K值似应为1.5。C6H12O6十1.5O2+NH3 C2H9O4N+CO2十H2O (9-32)根据摄氧率与糖耗速率之间的线性关系制定的加糖模型控制在加糖时发现，最佳K值应为1.75。(931) 利用K值和摄氧率可间接估算糖耗。从理论上按 图9-35所示三批谷氨酸发酵中K值对控制糖浓度的影响。K1.51时，糖耗估计过高，发酵罐中糖过量；而K2.16时，糖耗估计又过低；K1.75 时，加糖速率等于糖耗速率。 图9-35所示三批谷氨酸发酵中K值对控制糖浓度的影响。 表912 连续补料和分批补料发酵的比较项 目连

14、续法分批法批数加糖总量g残糖8L(以最终体积算)发酵时间h最终谷氨酸浓度糖转化率g/g4190393.323.095.20.5044139424.69790.80.479在30L发酵罐中进行了计算机控制系统与常规分批加糖方法的比较研究，其结果尽表9-12。实验证明，以估算糖耗为基础的连续加糖法可缩短发酵周期，而且最终谷氨酸浓度和转换率比分批加糖法高。 表912 连续补料和分批补料发酵的比较批养分或前体比吸收速率所需补料速率已糖NH3PO43SO42苯乙酸0.33 mmolg-1h-1 1.6(最适)mmolg-1h-11.2在0.015 h-19.0mg g-1h-1o.6mg g-1h-19

15、.8mg g-1h-11.8mg g-1h-113.2mm01L-1h-1 64.0mm01L-1h-180mgL-1h-121mg g-1h-1112.0mg g-1h-172.0mg g-1h-1表913产黄青霉菌突变株的各种养分比吸收速率已糖0.33 mmolg-1h-1 1.6(最适)mmoBajpa等选用一套生长、青霉素生产、基质和氧消耗的模型，用这模型来优化恒定的补糖速率和KLa和青霉素的补糖速率，如图9-36，补糖速率的最佳点与设备的供氧能力有关，KLa大的，补料速率相应也大，同时生产水平也高。供氧能低的设备(KLa80h-1)补料速率也相应的要减少，才能达到在这一设备中生产的最

16、高水平。但其产量要比供氧能力好的设备降低23%。 Bajpa等选用一套生长、青霉素生产、基质和氧消耗的模型，用补料蠕动泵酸碱调节泵补料蠕动泵酸碱调节泵 控制发酵的培养基成分 次级代谢产物的生成大多与快速被利用碳源(主要是葡萄糖)的消耗密切相关。只有在葡萄糖几乎耗尽，生长停止时，才开始大量合成次级代谢产物。 避免葡萄糖效应 常采用 混合碳源培养基 流加葡萄糖 控制发酵的培养基成分实例1 避免葡萄糖效应在发酵过程中的应用 补糖与排气二氧化碳、pH变化关系 在青霉素发酵中补糖将引起排气二氧化碳浓度的增加和培养液pH下降。所产生的二氧化碳可以用青霉素产生菌的生长和产物形成的化学简式来说明，见下式，随着

17、糖耗的增加，CER也增加。 菌体生长 C6H12O6十NH3十3.3O2十0.06H2SO4 0.42C71H13.2O4.4N0.06S十3CO2十4.8H2O 菌体维持 C6H12O6十6O2 6CO2十6 H2O 青霉素生产 C6H12O6十(NH4)2SO4十0.5O2 十PAA C16H17O4N2S十2CO2十H2O实例1 避免葡萄糖效应在发酵过程中的应用 葡萄糖的补入，排气二氧化碳增加，pH下降。原因有两个方面一是葡萄糖被菌利用产生二氧化碳，其中溶解的二氧化碳使培养液pH下降另一方面葡萄糖被菌利用过程中产生有机酸，使pH下降。糖、CO2、pH三者有相关性，被青霉素工业生产上用于补

18、料控制的参数，排气二氧化碳的变化比pH变化更为敏感。 葡萄糖的补入，排气二氧化碳增加，pH下降。原因有两个pH时间/hrpH时间/hr实例3 基因工程菌毕赤酵母高密度高表达发酵过程GS115宿主菌染色体上AOX1基因被外源基因替代示意图HAS-1(Mut+)表达rh-SA发酵过程细胞密度和表达水平曲线特点:甲醇作唯一能源和碳源的特性，外源基因插在能够利用甲醇的AOX基因中，甲醇诱导醇氧化酶来利用甲醇，同时启动表达外源基因的AOX的启动子(PAOX)表达外源基因蛋白，因此在外源表达阶段只有用甲醇来诱导。实例3 基因工程菌毕赤酵母高密度高表达发酵过程GS115宿不同甲醇浓度时甲醇代谢关键酶酶活变化

19、过渡阶段甲醇代谢途径关键酶酶活性曲线不同甲醇浓度时甲醇代谢关键酶酶活变化过渡阶段甲醇代谢途径关键毕赤酵母基因工程植酸酶发酵三阶段一、甘油 酵母细胞营养生长阶段 (生长的特征是什么： 溶氧降低生物量增加)二、生长与表达的过渡阶段甘油耗尽细胞饥饿甲醇诱导（甘油耗尽的特征是什么：甘油渐少甲醇渐增 溶氧降至最低点，甘油耗尽即补甲醇 回升至高点不变）三、外源蛋白表达流加甲醇诱导AOX基因产生醇氧化酶利用甲醇启动表达外源基因的AOX启动子(PAOX)表达外源 基因蛋白(外源基因插在能够利用甲醇的AOX基因中) （甲醇的正面和负面作用：诱导和供碳源；对细胞有毒害作用）毕赤酵母基因工程植酸酶发酵三阶段一、甘油

20、 基因工程植酸酶发酵OUR:150200 mol/h.m3基因工程植酸酶发酵OUR:150200 mol/h.m3特点高密度 先得到高的细胞量发酵分阶段 生长和诱导碳源为甘油和甲醇甲醇作碳源也作诱导剂精确的控制 微观代谢反应在宏观数据上，反过来宏观数据又调节代谢方向的进行特点高密度 先得到高的细胞量 第九节 发酵终点的判断 不同类型的发酵，要求达到的目标不同，因而对发酵终点的判断标准也应有所不同。一般对发酵及原材料成本占整个生产成本主要部分的发酵品种，主要追求提高生产率(kg/m3h)，（体积生产率）得率(kg产物/kg基质)发酵系数(kg产物罐容积m3发酵周期h)。 如下游提取精制成本占主要

21、部分，和产品价格比较贵，则除了要求高的产率和发酵系数外还要求高的产物浓度。 第九节 发酵终点的判断计算总的生产率，应以放罐时发酵单位除以总的发酵生产对间，而总发酵生产时间不仅包括发酵周期，也包括从前一批放罐、洗罐和消毒新培养基所需的时间，如下图所示。总的生产率可用从发酵终点到下批发酵终点间的直线斜率来代表最高生产率可通过原点与生长或产物浓度曲线相切的直线来代表；切点处的细胞或产物浓度比终点最大值低。计算总的生产率，应以放罐时发酵单位除以总的发酵生产对间，而从式933可求出发酵总的生产周期：(9-33)tT,tD和tL放罐、洗罐、检修的工作时间，打料、灭菌时间和停滞期所需时间；X0和XF起始和终

22、了的细胞浓曲， 最大比生长速率。从式933可求出发酵总的生产周期：(9-33)tT,tD和如要提高总的生产率则有必要缩短发酵周期。这就是要在产物合成速率较低时放罐，延长发酵虽然略能提高产物浓度，但生产率下降，且消耗每千瓦电力，每吨冷却水所得产量也下跌，成本提高。放罐时间对下游工序有很大影响。如放罐时间过早，会残留“过多的养分，如糖、脂肪、可溶性蛋白等,对提取不利，这些物质能增加乳化作用或干扰树脂的交换2如放罐时间太晚，菌丝自溶，不仅会延长过滤时间还会使一些不稳定的抗生素单位下跌，扰乱提取工段的作业计划。 放罐临近时，加糖、补料或消沫油都要慎重，因残留物对提炼有影响。补料可根据糖耗速度计算到放罐

23、时允许的残留量来控制，一般放罐前16小时左右便停止加糖或消沫油。 如要提高总的生产率则有必要缩短发酵周期。00.511.522.53081624324048566472808896104112120时间(t)井冈霉素A/%原始菌和诱变菌发酵过程产井冈霉素曲线诱变菌K-2-27原始菌KN-1600.511.522.5308162432404856647菌株井冈霉素A产量g/100ml 生产率（g产物/Lh） 得率（g产物/g基质） 发酵系数（g产物/罐容积L发酵周期h）KN-161.910.3980.1910.177K-2-273.810.3370.3810.185原始菌和诱变菌生产率、得率、发

24、酵系数比较 KN-161.910.3980.1910.177K-判断放罐的指标主要有 产物浓度过滤速度、 粘度氨基氮、菌丝形态、pH、培养液的外观等。 一般菌体自溶前总有些迹象，如氨基氮开始升高，PH上升，菌丝碎片增多，粘度增加，过滤速度降低，最后一项对染菌罐尤为重要。 老品种的抗生素发酵放罐时间一般都根据作业计划放罐。但在发酵异常(包括染菌)的情况下，放罐时间就需当机立断，以免倒罐。新品种发酵更需摸索合理的放罐时间。不同抗生素品种的发酵终点的判断略有出入，绝大多数掌握在菌丝开始自溶前，极少数则在菌丝部分自溶后，以便抗生素在菌丝体内释放出来。总之，发酵终点的判断须综合多方面的因素统筹考虑。判断放罐的指标主要有 讨论题 1、工业微生物的应用开发方面有哪些工作可做，你认为