DB1301-T077-2013牛乳中皮革水解蛋白的检测-全自动氨基酸分析仪法

1、B43DB1301石家庄市地方标准DB1301/T0772013牛乳中皮革水解蛋白的检测全自动氨基酸分析仪法2013-07-19 发布2013-08-20 实施石家庄市质量技术监督局发布DB1301/T0772013 PAGE 5前言本标准的附录 A 为资料性附录。本标准由石家庄市畜牧水产局提出。本标准起草单位：石家庄市畜产品监测中心本标准主要起草人：肖妙、何立宁、谢峰、杨洁、张梦雪、王新、曹振ft、孟祥日。牛乳中皮革水解蛋白的检测全自动氨基酸分析仪法范围本标准规定了全自动氨基酸分析仪检测牛乳中皮革水解蛋白的方法。本标准适用于原料乳及与液态乳制品。本标准检出限为 5.00mg/L，定量限为 1

2、2.5mg/L。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/ T 6682 分析实验室用水规则和试验方法原理用高浓度盐酸水解牛乳或乳制品中的蛋白，过滤后定容。取部分试样浓缩后，再加入稀盐酸溶解、定容。注入氨基酸分析仪分析，外标法定量。试剂和材料除另有说明外，其余试剂均为优级纯规格。水：GB/T 6682 规定的一级水。甲醇：色谱纯。茚三酮：色谱纯。L(-)-羟脯氨酸标

3、准物质：纯度99。7.8 mol/L 盐酸溶液：取 650mL 优级纯的浓盐酸，加入到 350mL 水中。0.1 mol/L 稀盐酸溶液：吸取 8.3mL 的浓盐酸，加入 1000mL 水中，混匀。5苯酚：称取 5g 新蒸馏的苯酚，溶于 100mL 水中。流动相。缓冲液：称取柠檬酸三钠 11.8g+柠檬酸 6.0g+甲醇 65mL+盐酸 6.5mL，去离子水定容至 1L，氢氧化钠调 pH 至 3.45。再生液：称取氢氧化钠 20.0g，去离子水定容至 1L。茚三酮溶液：称取茚三酮 20g+苯酚 2g+甲醇 600ml+钾钠缓冲液 400m（l pH5.51，三水乙酸钠 272.0g+醋酸钾 1

4、96.0g+乙酸 200ml，去离子水定容到 1L），去离子水定容至 1L。每 1000ml 茚三酮溶液中，加入 0.2g 抗坏血酸，或用甲醇溶解后加入。甲醇水溶液：V 甲醇：V 水=1:1。L(-)-羟脯氨酸标准溶液。L(-)-羟脯氨酸标准储备液 500g/mL:称取 50.0mg L(-)-羟脯氨酸标准对照品置 100mL 容量瓶中，用 0.1mol/L 的盐酸溶液定容至刻度。4冰箱保存，有效期 3 个月。L(-)-羟脯氨酸标准中间溶液 50g/mL:吸取标准储备液 5.00mL 于 50mL 容量瓶中，用 0.1mol/L 的盐酸溶液定容至刻度。4冰箱保存，有效期 7 天。水解管：25m

5、L。滤膜：水相，0.45m。一次性注射器：2mL。仪器全自动氨基酸分析仪。溶剂过滤器。测定步骤试样制备准确吸取 2mL 生鲜乳试样，加入 8mL7.8 mol/L 盐酸溶液（4.5），摇匀，滴加 34 滴新蒸馏的苯酚（4.7）；氮吹 2min，封管。置 110烘箱内水解 24h；将水解液过滤；取 0.2mL 的滤液，用氮吹仪吹干；残留物用 0.1 mol/L 稀盐酸溶液（4.6）1.00mL 溶解，过 0.45m 滤膜（4.13），备用。全自动氨基酸分析仪的测定色谱条件色谱柱：Na+ 磺基水杨酸柱 LCA K06/Na 4.6mm150mm 或相当者。进样量：50uL。检测波长：440nm。柱

6、温程序：04min，柱温 30；47min，柱温由 30变化到 60；710min，柱温 60；1017min，柱温由 60变化到 30；1724min，柱温 30。缓冲泵流速：0.45mL/min，梯度洗脱如表 1。试剂泵流速：0.25mL/min ，茚三酮溶液：010 min，甲醇水溶液：10.0125.10 min。反应器温度：130。表 1缓冲泵洗脱梯度表Time(min)缓冲液 (%)再生液 (%)010004.0010007.0010007.10010011.0010011.10100025.101000标准曲线的绘制准确吸取 L(-)-羟脯氨酸标准中间溶液 0.40、5.00、2

7、0.00、50.00mL，分别置于 100mL 容量瓶中， 用 0.1mol/L 的盐酸溶液定容至刻度并摇匀，得到浓度为 0.20、2.50、10.00、25.00g/mL 的系列标准溶液。现用现配。以 0.20、2.50、10.00、25.00、50.00g/mL 系列浓度测得的峰面积绘制标准曲线。L(-)-羟脯氨酸对照品色谱图参见附录 A。试样测定分别取适量的试样溶液和相应浓度的标准工作溶液进样，获得目标峰面积。根据校准曲线计算被测试样中 L(-)-羟脯氨酸的含量（g/mL）。待测试样中 L(-)-羟脯氨酸的响应值均应在方法线性范围内。如果待测试样中 L(-)-羟脯氨酸的响应值超出方法线性范围的上限时，应将样品稀释后再进样分析。定量计算结果按以下公式计算：X CX V1 n 1000V2 1000式中：X：试样中 L(-)-羟脯氨酸的含量（mg/L）；Cx：标准曲线上查得的试样中 L(-)-羟脯氨酸的浓度（g/mL）； n：稀释倍数 ；V1 ：试样定容体积（mL）； V2 ：试样量取体积（mL）。计算结果有效数字结果以两个平行测试数的算术平均值表示，保留三位有效数字。空白实验除以水代替样品外，均按以上步骤同时做空白试验。灵敏