单克隆抗体 (2)讲稿

1、关于单克隆抗体 (2)第一张，PPT共五十三页，创作于2022年6月一、相关免疫学基础及问题的引出免疫系统（immune system）是机体执行免疫应答及免疫功能的一个重要系统。由免疫器官、免疫组织、免疫细胞和免疫分子组成。是防卫病原体入侵最有效的武器，它能发现并清除异物、外来病原微生物等引起内环境波动的因素。但其功能的亢进会对自身器官或组织产生伤害。第二张，PPT共五十三页，创作于2022年6月骨髓骨髓造血干细胞B细胞在骨髓微环境中，HSC首先分化为髓样前体细胞和淋巴样前体细胞。髓样前体细胞最终分化为粒细胞、单核细胞、红细胞、血小板；淋巴样前体细胞分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞

2、。骨髓中产生的淋巴样前体细胞循不同的途径分化发育，其中一部分在骨髓内发生抗原受体（BCR）等表面标志物的表达、选择性发育或凋亡等。最终分化为成熟的B细胞。B细胞进入血液循环，定居在外周免疫器官。抗体是B细胞接受抗原刺激后增殖、分化为浆细胞，产生的糖蛋白，是介导体液免疫的重要效应分子。第三张，PPT共五十三页，创作于2022年6月免疫球蛋白的生物学活性1）与相应抗原特异性结合2）激活补体3）结合细胞，产生多种生物学效应4）通过胎盘被动免疫第四张，PPT共五十三页，创作于2022年6月二、 人工制备抗体（一） 多克隆抗体（二） 单克隆抗体 1 单克隆抗体技术 2 人源单克隆抗体 （三） 基因工程抗

3、体（四）单克隆抗体的应用第五张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。（一） 多克隆抗体第六张，PPT共五十三页，创作于2022年6月一群B淋巴细胞 bac抗原 bac抗原a决定簇相应抗体（单克隆）b决定簇相应抗体（单克隆）c决定簇相应抗体 （单克隆） 针对同一抗原的多个单克隆抗体混合在 一起叫多克隆抗体ac抗原ac抗原 b b第七张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 多克隆抗体的制备过程第八张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 多

4、克隆抗体的用途：中和抗原、免疫调理、介导 ADCC等 多克隆抗体的局限性：特异性不高、易发生交叉反 应、不易大量制备第九张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 动物脾脏和淋巴结内有上百万个B淋巴 细胞，每个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定簇产生的抗体是单克隆抗体。（二）单克隆抗体第十张，PPT共五十三页，创作于2022年6月单克隆抗体：利用细胞融合技术，将能够产生抗体 的B淋巴细胞（antigen stimulated B lymphoblast)和具有无限增殖能力的骨 髓瘤细胞(myeloma)融合在一起，形成 杂交瘤细胞(hybridoma cell)。杂交瘤 细胞既能在体

5、外无限增殖，又能持续 分泌成分单一的特异性抗体。这种单 一类型的只针对某一特定抗原决定簇 的抗体分子，就是单克隆抗体。第十一张，PPT共五十三页，创作于2022年6月1、单克隆抗体技术第十二张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（1） 融合亲本细胞的选择（2） 融合细胞的制备（3） 杂交瘤细胞的的筛选（4） 分泌目标抗体的杂交瘤细胞 的筛选（5）单克隆抗体的大量生产技术流程第十三张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（1） 融合亲本细胞的选择 B细胞最佳来源： 高度免疫个体的激活淋巴细胞。采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品系的动物进行免疫。 抗体生成细胞（B细胞）第十四张，PPT共五十三页

6、，创作于2022年6月动物免疫：目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.特定目标抗原免疫动物刺激淋巴结、脾脏中B淋巴细胞B淋巴细胞大量增殖能分泌针对于该抗原的特异性抗体一般要经过初次免疫、第二次免疫、加强免疫（向动物静脉内注射抗原）三个过程。第十五张，PPT共五十三页，创作于2022年6月当选定动物品系和抗原后，应仔细设计免疫方案，应考虑如下问题： 抗原的性状 免疫途径 免疫次数 再次免疫间隔时间 是否使用佐剂 使用何种佐剂 动物对抗原的免疫应答状况检测第十六张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 颗粒性抗原有较强的抗原性，免疫时不加佐剂。可溶 性抗原

7、需添加适量的佐剂，增强免疫效果。 可溶性抗原可经过化学修饰或将其固定在载体上使之成为颗粒 性抗原。半抗原需与蛋白或其它载体共价连接后再开始免疫。 细胞作为免疫原时，应对细胞尽量洗涤，以除去培养 液中的外源性蛋白，如牛血清蛋白。不同类型抗原的免疫方式：第十七张，PPT共五十三页，创作于2022年6月脾细胞制备、分离 在末次免疫后3-5d左右即可取脾脏分离淋巴细胞。收集过程要严格无菌。脱颈处死小鼠，依次用2.5%碘酊和75%酒精进行皮肤消毒，打开腹腔，小心取出脾脏，注入0.5ml无血清培养基使脾脏轻度肿胀，用小号针头多点刺破脾脏被膜，轻轻挤压使淋巴细胞逸出。需要的话可用抗原再做一下富集。第十八张，

8、PPT共五十三页，创作于2022年6月骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞的诱导：一些品系的小鼠经腹腔注射矿物油可诱生出骨髓瘤。用8-杂氮鸟嘌呤（8-Az）或6-巯基嘌呤（6-TG） 来筛选HGPRT- (次黄嘌呤鸟嘌呤磷酰核糖转移酶)突变体。 用 Br-脱氧嘧啶核苷来筛选TK-(胸腺嘧啶核苷激酶)突变体。筛选机理： 由于HGPRT或TK在利用补救途径合成DNA时可将这些碱基类似物掺入DNA而导致细胞死亡。逐步提高这些药浓度，使HGPRT+或TK+细胞全部死亡，而HGPRT-或TK-因不会掺入这些碱基类似物而存活下来。第十九张，PPT共五十三页，创作于2022年6月第二十张，PPT共五十三页，创作于2022年

9、6月 骨髓瘤细胞制备的注意事项用作杂交瘤亲本的骨髓瘤细胞本身不分泌任何抗体或免疫球蛋白，否则将可能影响单克隆抗体产生。骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高。对融合效率高的亲本骨髓瘤细胞应及时扩增，冻存。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。在培养过程中可加入8-AZ或6-TG以防HGPRT酶缺失回复突变。第二十一张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（2）融合细胞制备培养基：DMEM(多用于小鼠细胞融合) RPMI1640(制备人单克隆抗体) 血清：预实验筛选能够促进克隆细胞生长或使 融合细胞迅速增殖的血清。制备单克隆 抗体以胎牛血清

10、为好。或使用无血清培 养基。 抗生素：青霉素、链霉素、庆大霉素、卡纳霉素、 两性霉素B以及制霉菌素 动物细胞融合的几种方法？第二十二张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心710分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻地振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG 0.5 ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入510ml不含血清的培养液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，之后静置10分钟。洗涤后，培养筛选融合细胞。PEG 融合举例第二十三张

11、，PPT共五十三页，创作于2022年6月 -培养基的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）所以取三者的字头称为HAT培养基。（3）融合细胞的筛选基于细胞瘤突变株的HAT培养基的筛选法第二十四张，PPT共五十三页，创作于2022年6月-亲本细胞的特性骨髓瘤细胞myeloma：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酰核糖转移酶）或TK（胸腺嘧啶核苷激酶）。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。淋巴细胞lymphocytes：经过免疫处理的淋巴细胞，多用

12、大鼠或小鼠。第二十五张，PPT共五十三页，创作于2022年6月-融合后的各种类型细胞的命运融合的B细胞和瘤细胞： 由于杂交细胞获得了（1）B细胞的HGPRT、 TK 酶基因并正常表达、利用培养基中的H、T 合成DNA（2）瘤细胞的“永生性”而得以存活和无限扩增。未融合的B细胞、融合的B细胞和B细胞以及B细胞的多聚体： 虽然有HGPRT、 TK 酶基因并正常表达，但是逃脱不了有限存活的命运。正常的B细胞在培养基中存活仅 5 7天。未融合的瘤细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、以及瘤细胞的多聚体等： 因不能正常合成DNA而死亡。第二十六张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 杂氮丝氨酸取代氨基喋呤的作

13、用 腺嘌呤（A）取代次黄嘌呤（H）构成AAT培养基第二十七张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（4）分泌目标抗体的杂交瘤细胞的筛选必要性：通过选择性培养而获得的杂交瘤细胞系中，仅少 数能分泌针对免疫原的特异性抗体。 方法：ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等单克隆抗体（McAb）的检测。放射免疫法 （RIA）用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。间接免疫萤光法 （IFA）用于细胞和病毒McAb的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。第二十八张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（

14、5） 单克隆抗体的大量生产实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按接种于小鼠背部皮下。待肿瘤达到一定 大小后(一般1020天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml。采血量有限。腹水制备法 腹腔注射杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，处死小 鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。 可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法。体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗 体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060g ml。如果大量生产，费用较高。 生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗。第二十九张，

15、PPT共五十三页，创作于2022年6月2，人源性单克隆抗体制备 问题的提出：鼠源性单抗的局限性。引起人抗鼠反应抗体很快被机体清除产生过敏反应、不能有效激发机体免 疫防御系统目标：获得低免疫原性、高效性、人源性 单克隆抗体 困难：缺乏像小鼠骨髓瘤那样的融合效率高、 性状稳定的融合亲本细胞系，不能用任 意抗原免疫人体获得足够数量的抗原特 异性B细胞第三十张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 EBV制备 无支原体污染的B95-8（EBV转化的绒猴白细胞 ） 在诱导剂（如正丁酸）的作用下制备病毒。培养 2-3d后，收集上清，0.4m孔径滤膜过滤，获得 病毒，液氮冻存备用。 制备用于转化的B淋巴细

16、胞 用淋巴结、扁桃体、脐带血、外周血，泛影葡胺- 聚蔗糖密度梯度离心分离人B淋巴细胞，离心沉淀 细胞。（1）EB病毒转化制备人源单克隆抗体技术第三十一张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 转化 加入新配置的病毒液（含10%胎牛血清的RPMI- 1640培养液与病毒过滤液1:1混合），调整细 胞浓度107个细胞/ml,温浴2-3h,弃上清，加入 含20%血清的RPMI-1640培养液，接种于96孔板 中，每孔接种量0.1-0.5个细胞/ml,每3-5d换 液一次。约一周左右即可见到转化的细胞。 传代、冻存、监测一些淋巴母细胞也能释放病毒，当这些淋巴母细胞与淋巴细胞共养时，也能诱导出分泌抗体

17、的转化细胞。第三十二张，PPT共五十三页，创作于2022年6月实际操作中影响EBV对细胞转化的影响因素及注意 事项： 支原体污染，导致转化效率低 血清中抗体阳性者体内存在对病毒特异性记忆细胞，机体会 产生对EBV的免疫反应，特别是细胞免疫反应，因此应采用 抗体阴性个体的B淋巴细胞或将T细胞除去。 转化后，细胞明显增殖时应及时传代，并检测上清免疫球蛋 白和抗体分泌情况。 EBV转化B细胞克隆效率低，提高克隆成功率十分困难。转化 细胞抗体分泌能力不稳定。第三十三张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（2）细胞工程单克隆抗体技术人鼠杂交瘤单克隆抗体 基本方法与鼠-鼠杂交相同。 Nowinski(

18、1980)报道在体外用流感病毒致敏人 脾细胞,再与NS-1(小鼠骨髓瘤细胞)细胞融合， 成功地得到了针对Forssman抗原 (嗜异性抗原 )的人单克隆抗体。人-鼠杂交瘤的人单克隆抗体分泌性很不稳定。可 能是由于人染色体丢失或信号传递缺乏相关。第三十四张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 人-人杂交瘤单克隆抗体 人-人杂交瘤单克隆抗体核型稳定 但可供利用的人类骨髓瘤细胞种类非常有限。 加上人B淋巴母细胞系和淋巴瘤细胞共有三十 几株。目前实验室仍较多使用由EBV转化的B 细胞筛选出来的淋巴母细胞系。 人类骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞种类很少，实际 应用中，融合率低，形成的杂交瘤分泌抗体 少，远不

19、及制备鼠单抗的融合亲本骨髓瘤细 胞相比。第三十五张，PPT共五十三页，创作于2022年6月EBV转化-融合技术 EBV转化后的B淋巴细胞与鼠源骨髓瘤细胞融合，产生一系列人鼠杂家瘤细胞系（series of human-mousehybridyzation,SHM）。此种杂交瘤生长快，含较多人抗体，抗体分泌稳定。第三十六张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 转基因动物制备抗体 将改造过的人的抗体基因导入小鼠胚胎，以得到在 免疫后能产生人抗体的转基因小鼠。 这种改造过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位 的轻、重链各三个互补决定区（complementariy- determining re

20、gion ,CDR）是鼠源性的，其余部 分均是人源性的。 转人球蛋白基因小鼠的构建为人单抗制备过程解决体 内致敏受限问题提供了一条新的途径。 第三十七张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体 将人免疫干细胞移植到SCID小鼠（染色体突变，使T、B淋巴细胞功能障碍导致联合免疫缺陷）体内，使其获得人的免疫系统。这种小鼠可以用任何抗原免疫，从激活的淋巴细胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细胞，进一步进行细胞融合或制备抗体库。第三十八张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（三）基因工程单克隆抗体技术 利用细胞工程制备人单克隆抗体，由于缺乏合适的融合亲本细胞系、不能用

21、任意抗原免疫人体并随意从人体中分离淋巴细胞、杂交瘤融合频率低、抗体分泌稳定性差等限制因素。而鼠源性抗体应用又有其固有的局限性。于是人们试图用基因工程抗体技术制备人源性单抗。第三十九张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（一）免疫球蛋白的结构（二）免疫球蛋白的生物学活性第四十张，PPT共五十三页，创作于2022年6月Amino terminal endCarboxy terminal endVariable regionsConstant regionsFab fratgmentsFc fragment（一）免疫球蛋白的结构第四十一张，PPT共五十三页，创作于2022年6月抗体结构为Y形，一

22、个抗体分子由两个相同的轻链分子（L）（约210个氨基酸残基）与两个相同的重链分子（H）组成（约450个氨基酸残基）。轻链有和两种，重链有、和五种。 整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。 抗体“Y”的两臂末端约110个氨基酸序列的变化很大，称为可变区。可变区重链和轻链各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度变化，称为高变区(HVR)或互补决定区(CDR)，分别为CDRl、CDR2和CDR3。 高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原的特异性。第四十二张，PPT共五十三页，创作于2022年6月在一定条件下，免疫球蛋白分子肽链的某

23、些部分已被蛋白酶水解为各种片段。 木瓜蛋白酶：两个完全相同的Fab段和一个Fc段 胃蛋白酶：一个大片段F（ab）2和一些小片段pFc第四十三张，PPT共五十三页，创作于2022年6月1.人鼠嵌合型抗体 用人源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc区。 过程：用cDNA文库法或IgDNA文库法，制备含编码 小鼠单克隆抗体可变区基因（VH、VL基因）的M13 质粒，测序后，分别与人的CH、CL基因重组，构成 嵌合体基因，再用不同的转染技术将重组基因导入 小鼠骨髓瘤细胞中。 嵌合抗体未改变小鼠可变区序列，而保留了抗原特异性，而引 起人抗鼠免疫反应则大大降低，具有广阔的使用前景。第四十四张，PPT共五十三页

24、，创作于2022年6月2. 改型抗体 Winter 等克隆出鼠源抗体中与抗原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置换人抗体中相应序列。这种抗体绝大部分为人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为CDR移植抗体。这种抗体在人体内免疫性大为降低。制备难度极大。第四十五张，PPT共五十三页，创作于2022年6月3. 噬菌体库抗体 特点：避开体内免疫系统，在体外建立一个 相应于体内B细胞库的抗体库。这个技术摆脱 了体内免疫的限制，缩短了时间，而且可以 是全部人源的，是以往技术的突破进展。利 用噬菌体表面展示技术，建立了一个高效的 筛选系统。 具体流程：将从人或小鼠淋巴细胞中分离的 mRNA逆转录成cDN

25、A。通过PCR扩增编码轻重链 区的cDNA。然后用限制性内切酶酶解扩增的 cDNA片段，克隆到丝状噬菌体质粒载体中， 与丝状噬菌体蛋白（外壳蛋白）连接成融 合基因，经辅助噬菌体感染E.coli后，携带 有表达载体的E.coli就会释放外壳上带有抗 体片段的噬菌体。再用ELISA 或免疫亲和层析法即可筛选出特异性抗体。第四十六张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（四）单克隆抗体的特性和应用第四十七张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 1.理论研究 （1）分析B细胞多样性，揭示抗体产生 多样性的遗传机理 （2）进行表位分析-大量筛出抗原决 定簇第四十八张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.诊断试剂中的