乙肝六项操作及检验结果的解释课件

1、 乙肝六项的操作、注意事项及检验结果的解释乙肝六项操作HBSAg (双抗体夹心法）原理在微孔条上预包被，被纯化的乙肝表面抗体，配以酶标记抗体（HBsAb-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。乙肝六项操作HBSAg (双抗体夹心法）操作步骤一.准备1.1平衡：将试剂盒各组分别取出，平衡至室温（18-25），1.2配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按25倍稀释后使用。1.3编号：将微孔条固定于支架，按序编号。乙肝六项操作HBSAg (双抗体夹心法)结果判断与分析 临界值（C.O.）的计算：Cut

2、off临界值=阴性对照孔OD值N2.1，阴性对照OD均值大于0.05时按实际OD值计算，小于0.05时以0.05计算。 结果判定：样品OD值S/C.O=1者为HBsAg阳性样品OD值S/C.O1者为HBsAg阴性乙肝六项操作HBeAb检测（ELISA)竞争法 一.试剂准备同上 二.HBeAb操作 加样：分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各50l于相应孔中。 加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50l，轻轻混匀。 温育：置37温育30分钟，室温平衡5分钟。 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。 显色：每孔加入底物A、B各50l，轻拍混匀，置37暗处15

3、分钟。 终止：每孔加终止液50l，混匀。 三.HBeAb测定用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。乙肝六项操作HBeAb检测（ELISA)竞争法 四 .结果判断与分析临界值（C.O.）的计算：临界值（阴性对照孔OD值N+阳性对照孔OD值P）0.5， 结果判定：样品OD值S/C.O1者为HBeAb阴性注意：加底物显色，显色的强弱与待测标本中HBeAb的含量成反比。乙肝六项操作HBCAb测定（竞争法）原理在微孔条上预包被，被纯化乙肝核心抗原（HBcAg），配以酶标记抗体（HbcAb-HRP）及TMB等其它

4、试剂，采用竞争抑制法原理检测人血清（或血浆）中乙肝核心抗体（HBcAb）。乙肝六项操作HBCAb-lgM(捕获法）测定原理采用兔抗人HbcAg- IgM包被固相载体反应板，加入待测标本，同时加入HbcAg-HRP，当标本中存在HbcAb时，该HbcAb-IgM与包被HbcAg结合并与酶结合形成HBcAg-HbcAb-HBcAg-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。乙肝六项操作HBCAg-lgM(捕获法）8. 结果判断与分析8.1 临界值（C.O.）的计算：临界值阴性对照孔OD值N4，阴性对照OD均值小于0.05时以0.05计算，大于0.05时应实际OD值计算。8.2 结

5、果判定：样品OD值S/C.O=1者为阳性 样品OD值S/C.O1者为阴性9. 质量控制：每次均应有阴阳对照，其OD值应在要求范围内。ELISA法检测乙肝六项的注意事项 及结果分析 酶联免疫吸附试验(简称 ELISA 法)检测乙型肝炎免疫学标志物问世以来， 由于测定灵敏高 、特异好和操作简便等诸多优点， 具有实用性和可操作性 ，并广泛应用于各类医院实验室 ，作为检测乙肝血清标志物的首选 ，但通过对临床乙肝六项检测的观察、 存在不同血清物质变化及各种影响因素 ，直接或间接的影响检验结果的正确表达 。综合资料和实践 ，作如下探讨：1 样本的采集与处理影响1.1 样本离心处理不全， 使得标本严重溶血及

6、混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净 ，残留在孔内的血红蛋白，具有过氧化物酶样的活性， 催化底物显色造成假阳性， 溶血标本禁用。1.2 正常血液采集后半个小时至两小时开始凝固， 有时工作中为了快速检测 ，常会在血液未开始凝固时 ，即强行离心分离血清 。特别是在冬天 使得血清中残留部分纤维蛋白原，在 ELISA 测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白凝块附着在酶标反应孔壁内使得不易洗掉 易造成假阳(阴)性、 影响结果 。因此血液标本采集后要使其充分凝固后再分离血清，标本离心时 ，可加大离心转速 ，延长离心时间 或者要节约时间就用带分离胶的采血管采集标本。1.3 血清标本应避免细菌污染，

7、 细菌的一些内源性酶本身会对相应酶作标记测定方法产生干扰。1.4 标本储存时间不宜过长， 应新鲜 4 保存不宜超过7天 ，以免因标本中的 IgG 聚合导致本底加深 甚至假阳性，影响判断结果。2 试剂的影响2.1 试剂盒在运输中时间太长 ，温度过高会使显色偏淡，灵敏度偏低 ，要求试剂盒应存放于 2 -8 冰箱中，从冷藏环境中取出的试剂盒、全部瓶装试剂以及待测标本所需的微孔反应板，都应预先在室温下平衡后，再开启使用 。余者应及时封存于冰箱。不同批号试剂盒中的组份、不能进行交叉使用 ，包括试剂瓶盖，相互交叉使用 ，有可能出现显色浅或本底高 ，花板情况。 所以不同试剂瓶盖不能混淆，试剂盒不要使用超过有

8、效期。3 操作技术的影响3.1 加样吸嘴的洁净和吸液量的准确性直接影响结果 ，移液器吸量不足 ，移液抽吸排放太快， 吸头内壁挂液太多或内壁不清洁， 所以要定期校正移液器， 吸头要配套， 每次装吸头要吻合紧密， 移液不宜过快， 排放应完全 ，尽可能使用同一移液器和装紧吸头移液时用力及抽吸速度均匀一致 加样后要充分混匀 ，在 100 ul和 50 ul的移液不精密度应 在1%范围以内， 分别在99 -101 ul和 49.5- 50.5 ul之间。3.2 温浴影响 96 孔酶标板结构特别 ，易产生边缘效应 ，抗原抗体结合及酶促反应对温度要求严格， 标本要贴好密封膜 ，防止水蒸气和污物浸入， 放置

9、37 水浴箱时 ，应让反应孔底部 2/3 浸入水中， 才能减少受热不均 避免边缘效应 ，干浴与水浴存在明显的差异 ，尽可能使用水浴 ，并控制好水浴时间。3.4 显色剂应避光保存 滴加显色剂 A 、B 时 ，顺序不能颠倒 ，注意不要漏加， 显色时间要严格控制， 可用计时器来计时，保证准确， 肉眼判断结果时， 显色浅不易观察， 影响结果准确性， 必须使用酶标仪检测结果， 以保证结果一致性 ，滴加终止液后随着时间的增加， 吸光度值逐渐下降， 而且浓度越高其吸光度随时间下降越快， 可能会产生假阳性或假阴性结果，建议在终止反应后立即比色。4 钩状效应(Hook)影响随着 ELISA 一步法的应用 ，在日

10、常工作中会发现 HBsAg阴性而 HBeAg 阳性的现象 ，其原因就是当标本中的抗原浓度过高时产生的钩状效应 (Hook)现象 ，从而出现假阴性造成真阳性的漏检， 即随着被测物浓度增高反而显色减弱甚至不显色， 往往造成假阴性结果 ，采用同步稀释测定或用线性范围高的乙肝六项定量法可以减少 Hook 效应的发生。6 药物的影响 高效价的乙肝免疫球蛋白会与表面抗原形成复合物,影响 HBsAg 的检出,所以一些 HBsAg 阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后,HBsAg 检测会呈阴性反应,导致乙肝两对半少见模式的出现。为预防乙肝，部分 HBsAg 阴性人群在接种乙肝疫苗后的 1 2 周内，血清中可检出 HB

11、sAg 成分，形成一过性HBsAg 阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是 HBsAg，建议接种乙肝疫苗后 1 个月内不应作 HBsAg 检测。 总之,没有严格的室内质控,没有规范的操作规程,结果判定用肉眼而不用仪器,操作随意(如试剂自冰箱取出后不复温,温育时不封板,洗板后无扣板过程),试剂、仪器、器材(如微量移液器)质量差等。而对一些操作细节(如温育时间的控制)的忽视都可能导致结果的不同。乙肝六项检测必须排除各种影响因素的干扰，才能为临床提供正确可靠的检测依据。乙肝表面抗原前S1HBSAg前S1：1.主要存在于完整乙肝病毒表面 ,2.肝细胞膜上存在有前S1蛋白受体 ,3.诱导乙肝病毒吸附在肝细胞表

12、面 , 4.促使病毒进入肝细胞内.乙肝核心抗体临床意义乙型肝炎核心抗体是人体感染乙型肝炎病毒后第一个出现的抗体,是人体感染乙型肝炎病毒血清学标志物之一.乙型肝炎核心抗体又可分为乙型肝炎核心抗体IgM（抗HBc.IgM）和乙型肝炎核心抗体IgG(抗HBc.IgG)两种,前者随ALT升高而不断增长.大约在乙型肝炎病毒感染后1-2个月时,随者ALT升高而不断增长.大约在乙型肝炎病毒感染后1-2个月时,随之产生的便是乙型肝炎核心抗体IgG. 目前认为,抗HBc.IgM是乙型肝炎病毒新近感染或持续复制的标志,这种抗体持续阳性提示疾病迁延,而抗HBc.IgG的持续存在只能说明以往有过乙型肝炎病毒感染.因此

13、,乙型肝炎核心抗体IgM和IgG平行检测,有助于对急性乙型肝炎与隐匿型乙型肝炎和乙型肝炎病毒携带者急性发作之间的鉴别.约有20%急性乙型肝炎病人的血清中查不到乙型肝炎表面抗原,而乙型肝炎核心抗体IgM可阳性,而且与病情变化相一致,病情恢复,乙型肝炎核心抗体IgM阴转.当病情重新活动时,ALT重新出现异常时,乙型肝炎核心抗体IgM亦重新出现阳性,滴度上升.所以说,乙型肝炎核心抗体IgM是用来评价乙型肝炎病情的较好指标HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAbHBcAb- lgM简要意义乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗体乙型肝炎e抗原乙型肝炎e抗体乙型肝炎核心抗体乙型肝炎核心抗体lgMHBs

14、Ag是乙肝病毒标志物，阳性提示乙肝携带；HBeAg、HBcAb- lgM 阳性提示乙肝病毒复制活跃,传染性强,是治疗疗效评价的重要指标；HBsAb、HBeAb阳性提示机体产生免疫力抵抗病毒，趋于恢复。-没有乙肝病毒感染，不具备免疫力-+-接种疫苗，乙肝恢复，具备免疫力+-表面抗原携带；急性乙肝病毒感染潜伏期后期+-+-+急性乙肝早期，病毒复制，有传染性强+-+-+急慢性乙肝，病毒复制，有传染性强+-+-急慢性乙肝，没有传染性或传染性弱+-+-急慢性乙肝，没有传染性或传染性弱+-+急慢性乙肝，病毒复制有传染性，乙型肝炎E抗原变异-+-乙肝核心抗隐性携带，有乙肝既往有感染史-+-急性乙肝恢复期或既

15、往有感染史-+-+-乙肝恢复期或既往有轻度乙肝病毒感染史+-+-慢乙肝病毒感染携带，没有传染性或传染性弱+-+急性乙肝趋于恢复，表面抗原携带，病毒复制，有传染性强-+提示乙肝病毒早期感染，有传染性乙肝五项常见模式1 - - - - - 过去和现在未感染过HBV。 2 - - - - + (1)既往感染未能测出抗-HBs； (2)恢复期HBsAg已消， 抗-HBs尚未出现； (3)无症状HBsAg携带着。 3 - - - + + (1)既往感染过HBV； (2)急性HBV感染恢复期； 3)少数标本仍有传染性。 HBV感染已过； 抗HBs出现前的窗口期 4 - + - - - (1)注射过乙肝苗有免疫； （2)既往感染；假阳性