蛋白质序列分析

1、第六讲 蛋白质序列分析 第1页上节课回顾系统发育树构建第2页DNA sequenceProtein sequenceProtein structureProtein function第3页蛋白质结构预测过程4ORF翻译试验数据蛋白质序列蛋白质理化性质和一级结构数据库搜索结构域匹配已知结构同源蛋白？三维结构模型可用折叠模型？同源建模有二级结构预测无串线法有从头预测无第4页蛋白质结构分析蛋白质一级结构蛋白质基本理化性质分析蛋白质亲疏水性分析蛋白质跨膜区结构预测蛋白质二级结构蛋白质二级结构预测（螺旋，折叠等）蛋白质超二级结构蛋白质结构域分析蛋白质三级结构蛋白质三维结构模拟蛋白质结构分析主要内容第5页

2、理化性质: 分子量、等电点、氨基酸组成等结构分析：一级结构、二级结构、三级结构功效预测：motif、domain、信号肽、跨膜区、 亚细胞定位、蛋白质修饰等第6页蛋白质数据库介绍蛋白质结构主要分为四级, 一级结构、二级结构、三级结构以及四级结构。依据这种结构层次, 将蛋白质数据库分为: 1. 蛋白质序列数据库：如PIR、SWISS-PROT、NCBI , 这些数据库数据主要以蛋白质序列为主, 并赋予对应注释; 2. 蛋白质模体及结构域数据库：如PROSITE、Pfam, 这些数据库主要搜集了蛋白质保守结构域和功效域特征序列; 3. 蛋白质结构数据库： 如PDB 等, 这些数据库主要以蛋白质结构

3、测量数据为主; 4. 蛋白质分类数据库：如SCOP、CATH、FSSP 等, 这其中有以序列比较为基础序列分类数据库以及以结构比较为基础结构分类数据库之分。第7页 1.教授蛋白质分析系统：ExPaSy，Expert Protein Analysis System http:/www.expasy.ch/瑞士生物信息学研究所2. 生物序列分析中心：CBS，Center for Biological Sequencehttp:/www.cbs.dtu.dk/services/丹麦技术大学第8页9一、蛋白序列获取使用工具： ORFfinder、blastx二、蛋白质理化性质分析使用工具：ProtPa

4、ram三、跨膜区分析使用工具：TMpred四、二级结构分析使用工具：PredictProtein五、结构域分析使用工具：InterProScan六、蛋白质三级结构分析使用工具：SWISS-MODEL/SWISS-PdbViewer课程安排第9页一、蛋白序列取得1. 基因序列翻译推导得到2. 氨基酸（多肽）测序得到3. 双向电泳、质谱分析得到4. 数据库得到第10页例：某研究组测序得到一段序列 TTCAATCCTACTATCCACTATATGAAAGTGACGCCAATTATCTTCGCTGTATTTTGTGTCGTAGGTGCTATGACATTGATCACAGCTACAACGTTAGAGCAA

5、GCACCTCACCCGAGTGAAAAAGACATGGAATTAGTGTATATTGATGCAGAATATGAAAAAGAAGGTGGACTGAAATCAATATGCAACGAAATAAAACGGTCATTCAGAAAAGGGCGCCACCACATCTATAAAGTTATGGATAAATATATACGGAAGGAAGATTTAGGCATGAAAATGTTAGATGTTGCCAAAATCCTTGGAAGACGCATTGAAAAACGTATGGAATACATAGCGAAGAAACTGGATAAGATGATGGAATATGAATCGTCTTAGACTCTCCCAAATCCA 1. 基因序列翻译推导

6、得到第11页a. 利用ORF finder （不论数据库中有没有纪录均适宜）RESOURCES/Sequence Analysis第12页第13页第14页b. 利用Blastx （前提：GenBank 中有同源序列纪录）第15页第16页第17页第18页第19页第20页2.氨基酸（多肽）测序得到只适合于小分子蛋白/多肽第21页3. 双向电泳、质谱分析得到双向电泳第22页选择靶蛋白点一个靶蛋白点MS分析第23页/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF第24页4.从数据库中取得SRS（Sequence Retrieval System )序列检索系统（后不再使

7、用）第25页第26页胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP)第27页第28页Uniprot：联合蛋白质数据库 ，在NIH资助下，PIR、EBI和SIB共同创建了联合蛋白质数据库（United Protein Resource，UniProt），其首页网址为：/ 第29页第30页第31页第32页第33页取得fasta格式序列sp|P14136|GFAP_HUMAN Glial fibrillary acidic protein OS=Homo sapiens GN=GFAP PE=1 SV=1 MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGG

8、LAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRVDFSLAGALNA GFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRAKEPTKLADVYQAEL RELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEAT LARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRT QYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLR GTNESLERQMREQEERHVR

9、EAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQDLLNVKLALD IEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSVSEGHLKRNIVVKTVEMRDGEV IKESKQEHKDVM 第34页二、蛋白质一级结构a、理化性质b、跨膜区第35页36二（a）、蛋白质基本理化性质分析 蛋白质理化性质是蛋白质研究基础蛋白质基本性质：相对分子质量 氨基酸组成等电点（pI） 消光系数半衰期 不稳定系数总平均亲水性 试验方法：相对分子质量测定、等电点试验、沉降试验缺点：费时、耗资基于试验经验值计算机分析方法第36页工具网站备注AACompldent/tools/

10、aacomp/利用未知蛋白质氨基酸组成确认含有相同组成已知蛋白Compute pI/Mw/tools/pi_tool.html计算蛋白质序列等电点和分子量ProtParam/tools/protparam.html对氨基酸序列多个物理和化学参数（分子量、等电点、吸光系数等）进行计算PeptideMass/tools/peptide-mass.html计算对应肽段pI和分子量SAPShttp:/www.isrec.isb-sib.ch/software/SAPS_form.html利用蛋白质序列统计分析方法给出待测蛋白物理化学信息37蛋白质理化性质分析工具第37页38ProtParam 工具介绍

11、基于蛋白质序列组分分析氨基酸亲疏水性等分析为高级结构预测提供参考Expasy 开发针对蛋白质基本理化性质分析：ProtParam 工具 /tools/protparam.html计算以下物理化学性质：相对分子质量 氨基酸组成等电点（pI） 消光系数半衰期 不稳定系数总平均亲水性 第38页第39页第40页第41页第42页43主要选项/参数假如分析Swiss-Prot和TrEMBL数据库中序列直接填写Swiss-Prot/TrEMBL AC号(accession number)假如分析新序列：直接在搜索框中粘贴氨基酸序列输入Swiss-Prot/TrEMBL AC号将protein.txt蛋白质序

12、列粘贴在文本框中第43页44返回结果氨基酸数目相对分子质量理论 pI 值氨基酸组成正/负电荷残基数第44页45消光系数半衰期原子组成分子式总原子数E(Prot) = Num(Tyr)*Ext(Tyr) + Num(Trp)*Ext(Trp) + Num(Cystine)*Ext(Cystine)proteins in water measured at 280 nm: Ext(Tyr) = 1490, Ext(Trp) = 5500, Ext(Cystine) = 125Absorb(Prot) = E(Prot) / Molecular_weight第45页46不稳定系数脂肪系数总平均亲水性

13、40 unstable注意：ProtParam没有考虑蛋白质翻译后修饰、蛋白质多聚体等情况，故用户在预测和分析这类特定蛋白质基本理化性质时需要仔细审阅反馈结果。第46页(a)-Type I membrane protein(b)-Type II membrane protein(c)-Multipass transmembrane proteins(d)-Lipid chain-anchored membrane proteins(e)-GPI-anchored membrane proteins47二（b）蛋白质跨膜区分析第47页经典跨膜螺旋区主要是由2030个疏水性氨基酸（Leu、Ile、

14、Val、Met、Gly、Ala等）组成；亲水残基往往出现在疏水残基之间，对功效有主要作用；基于亲/疏水量和蛋白质跨膜区每个氨基酸统计学分布偏好性。48蛋白质跨膜区特征第48页跨膜蛋白序列“边界”标准胞外末端：Asp（天冬氨酸）、Ser（丝氨酸）和Pro（脯氨酸）胞外-内分界区：Trp（色氨酸）跨膜区：Leu（亮氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Val（缬氨酸）、Met（甲硫氨酸）、Phe（苯丙氨酸）、Trp（色氨酸）、Cys（半胱氨酸）、Ala（丙氨酸）、Pro（脯氨酸）和Gly（甘氨酸）胞内-外分界区：Tyr（络氨酸）、 Trp（色氨酸）和Phe（苯丙氨酸）胞内末端：Lys（赖氨酸）和Arg（精氨

15、酸）49第49页50惯用蛋白质跨膜区域分析工具工具网站备注DAShttp:/www.sbc.su.se/miklos/DAS/用Dense Alignment Surface（DAS）算法来预测无同源家族蛋白跨膜区HMMTOPhttp:/www.enzim.hu/hmmtop/由Enzymology研究所开发蛋白质跨膜区和拓扑结构预测程序SOSUIhttp:/bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/由Nagoya大学开发一个含有图形显示跨膜区程序TMAPhttp:/bioinfo.limbo.ifm.liu.se/tmap/基于多序列比对来预测跨膜区程序TMHMMhttp:/

16、www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0基于HMM方法蛋白质跨膜区预测工具TMpred/software/TMPRED_form.html基于对TMbase数据库统计分析来预测蛋白质跨膜区和跨膜方向TopPredhttp:/bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html是一个位于法国蛋白质拓扑结构预测程序第50页51http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/TMHMM第51页52TMpred 工具介绍TMpred工具：/software/TMPRED_form.html依靠跨膜蛋

17、白数据库TMbase预测跨膜区和跨膜方向第52页53主要参数/选项序列在线提交形式：直接贴入蛋白序列填写SwissProt/TrEMBL/EMBL/ESTID或AC输出格式最短和最长跨膜螺旋疏水区长度输入序列名（可选）选择序列格式贴入protein.txt蛋白质序列第53页54输出结果包含四个部分可能跨膜螺旋区相关性列表可能跨膜螺旋区位置分值片段中点位置相关性列表第54页55跨膜拓扑模型及图示提议跨膜拓扑模型最优拓扑结构每一位置计算分值第55页56第56页57第57页二级结构。螺旋， 是蛋白质中最常见最经典含量最丰富二级结构元件.在螺旋中，每轮卷曲螺旋包含3.6氨基酸残基，残基侧链伸向外侧,同

18、一肽链上每个残基酰胺氢和位于它后面第4个残基上羰基氧彼此之间形成氢键。在水环境中，肽键上酰胺氢和羰基氧既能形成内部(-螺旋内)氢键，也能与水分子形成氢键。不一样氨基酸对螺旋形成影响是不一样。三、蛋白质结构分析（一）、二级结构预测第58页 第59页 折叠 是经过肽链间或肽段间氢键维系。能够把它们想象为由折叠条状纸片侧向并排而成,每条纸片可看成是一条肽链, 称为折叠股或股(strand),肽主链沿纸条形成锯齿状。需要注意是在折叠片上侧链都垂直于折叠片平面,并交替从平面上下二侧伸出。第60页 无规则卷曲（random coil) 无规则卷曲或称卷曲(coil)，泛指那些不能被归入明确二级结构如折叠片

19、或螺旋多肽区段。 受侧链相互作用影响很大，经常组成酶活性部位和其它蛋白质特异功效部位如许多钙结合蛋白中结合钙离子EF手结构（E-F hand structure)中央环第61页 第62页 序列模体和结构域都是经过对相关蛋白质多序列比对分析而取得序列模体(Motif)，较短序列模式，结构域(Domains)，相对较长区域，经过序列谱取得，序列模体著名数据库为Prosite数据库。第63页第64页第65页第66页InterPro 蛋白家族信息（续）该家族蛋白在不一样种类生物体中出现情况其它家族与该家族重合情况第67页68五、蛋白质三维结构预测方法特点工具同源建模法( Homology/Compar

20、ative modelling )基于序列同源比对，对于序列相同度30序列模拟比较有效，最惯用方法 SWISS-MODELCPHmodels 串线法/折叠识别法 (Threading/Fold recognition)“穿”入已知各种蛋白质折叠骨架内，适于对蛋白质关键结构进行预测，计算量大THREADER3D-PSSM从头预测法( Ab initio/De novo methods )基于分子动力学，寻找能量最低构象，计算量大，只能做小分子预测HMMSTRROSSETA第68页69蛋白质结构预测精度第69页70同源建模法分析步骤：多序列比对与已经有晶体结构蛋白质序列比对确定是否有能够使用模板序

21、列相同度30%序列相同度30%，结合功效，蛋白质一级序列、二级结构或结构域信息构建三维模型三维模型准确性检验Whatcheck 程序Ramachandran plot计算检验手工调整多序列比对，重新拟合，构建新模型第70页71第71页72惯用三维结构数据库数据库网站备注PDB/pdb/home/home.do主要蛋白质三维结构数据库MMDB/Structure/MMDB/mmdb.shtmlNCBI维护蛋白质结构数据库Psdb/deerfiel/PSdb/从PDB和NRL-3D数据库中衍生出数据库，含二级结构和三维结构信息3DinSighthttp:/gibk26.bse.kyutech.ac

22、.jp/jouhou/3dinsight/3DinSight.html整合了结构、性质（氨基酸组成、热力学参数等）、生物学功效（突变点，相互作用等）综合数据库FSSPhttp:/www.ebi.ac.uk/dali/fssp/依据结构比正确蛋白质结构分类数据库SCOPhttp:/scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/蛋白质结构分类数据库，将已知结构蛋白进行有层次地分类CATH/latest/index.html另一个有名蛋白质结构和结构域主要结构分类库MODBASE/modbase-cgi/index.cgi用同源比对法生成模型结构数据库Enzyme Structurehtt

23、p:/www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/从PDB数据库中整理已知结构酶蛋白数据库HSSPhttp:/www.sander.ebi.ac.uk/hssp/依据同源性处处蛋白质结构数据库第72页73模板搜索与比对数据库工具网站备注PSI-BLAST/BLAST/位置特异性叠代BLAST，可用来搜索远源家族序列FASTA3http:/www.ebi.ac.uk/fasta33/位于EBI序列比对工具SSEARCHrs.fr/bin/ssearch-guess.cgi采取Smith/Waterman法来进行序列比对ClustalWhttp:/ww

24、w.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html多序列比对工具，位于EBIT-Coffeehttp:/www.ebi.ac.uk/t-coffee/用各种方法（如ClustalW、DIalign等）来构建多序列比对Multalinhttp:/bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html一个老牌多序列比对工具Dalihttp:/www.ebi.ac.uk/dali/三维结构比对网络服务器VAST/Structure/VAST/vast.shtml基于向量并列分析算法三维结构比对工具SAM-T99/rese

25、arch/compbio/sam.html用HMM法搜索蛋白质远源同源序列第73页74同源建模法工具网站备注SWISS-MODEL/完整建模程序，采取同源性判定来确定模板蛋白，用户也能够自定义模板进行分析CPHmodelshttp:/www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/基于神经网络同源建模工具，用户只需提交序列，无高级选项EsyPred3Dhttp:/www.fundp.ac.be/urbm/bioinfo/esypred/采取神经网络来提升同源建模准确性预测工具3Djigsawhttp:/www.bmm.icnet.uk/servers/3djigsaw/依据

26、同源已知结构蛋白来建模预测工具MODELLER/modeller/一个广泛使用同源建模软件，需要用户对脚本有一定了解第74页串线法工具网站备注3D-PSSMhttp:/www.sbg.bio.ic.ac.uk/3dpssm/index2.html第一个利用1D-3D序列profile来预测蛋白质折叠结构网络服务器Fuguehttp:/www-cryst.bioc.cam.ac.uk/fugue/以序列结构比对搜索数据库来预测蛋白质折叠HHpredhttp:/toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred基于HMM-HMM比对搜索多个数据库来预测给定序列折叠结构LOOPP/loo

27、pp.aspx学习、观察和输出蛋白质模式和结构工具THREADERhttp:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/threader/一个老牌线索分析软件，对搜索远源蛋白序列较敏感PROSPECT/structure/prospect/index.html蛋白质结构预测和评价工具包，能以一个非常简单方式运行，对于高级用户，也提供了很多可选项123D+http:/123/123D+.html结合了序列概形，二级结构信息和接触势能来将待测蛋白“穿入”一系列结构来预测结构SAM-T02/research/compbio/HMM-apps/T02-query.html基于HMM方法蛋白质结构预测Ge

28、nThreaderhttp:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/psiform.html使用结构评分和基于神经网络序列比对来也测蛋白折叠结构第75页76SWISS-MODEL工具介绍SWISS-MODEL工具/同源建模方法与PDB数据库已知结构蛋白质序列比对进行预测第76页自动模式比对模式工程模式SWISS-MODEL工作模式第77页78主要参数/选项粘贴SWISS-MODEL.txt中蛋白质序列输入用户E-mail（选填）第78页79模型和模板信息下载pdb格式文件模型和模板信息模型质量参数第79页80与模板序列比对结果并显示二级结构区域比对结果第80页81模型评定第8

29、1页82工具网站备注Swiss-PdbViewer/spdbv/一个界面非常友好工具，能够分析蛋白质结构性质，比较活性位点或突变点Jmol/一个基于Java语言开发三维观察工具，大多是作为一个内嵌式网页工具快速游览结构数据库数据MolMolhttp:/www.mol.biol.ethz.ch/wuthrich/software/molmol/无偿PDB三维分子观察软件，能够经过处理生成很漂亮图形文件PyMol/一个基于开源三维观察工具，有很多额外插件来提升功效Rasmol/software/rasmol/很有名三维观察软件，操作界面介绍，用命令行实现各种功效VMD/Research/vmd/用

30、内建脚原来浏览、分析三维结构，还能够以动画形式模拟蛋白质结构Chime/products/framework/chime/index.jsp网络游览器插件，能够在网页中直接观察PDB格式文件Chimera/chimera/index.html无偿分子模拟显示程序，还包含结构比对、药品筛选等功效ICM-Browser/icm_browser.html三维分子游览工具，有序列比对显示功效，由MolSodt企业无偿推出惯用蛋白质三维结构观察和修改工具第82页83PDB格式文件介绍统计类型说明END结束HEADER分子类，公布日期，ID号MASTER版权拥有者ORIGXn直角PDB坐标SCALEn直角

31、部分结晶学坐标AUTHOR结构测定者CAVEAT可能错误提醒COMPND化合物名称EXPDTA测定结构所用试验方法KEYWDS关键词OBSLTE注明该id号已改为新号SOURCE化合物起源SPRSDE已撤消或更改相关统计REMARK注解TITLE说明试验方法类型第83页PDB格式文件介绍（续）统计类型说明ANISOU温度因子ATOM标准基因原子坐标CISPEP顺势残基CONECT相关统计DBREF其它序列库相关统计HELIX螺旋HET非标准残基HETSYM非标准残基同义字HYDBND氢键LINK残基间化学键MODRES对标准残基修饰MTRIXn显示非晶相对称REVDAT修订日期及相关内容SEQ

32、ADVPDB与其它统计出入SEQRES残基序列SHEET片层统计类型说明SIGATM标准差SIGUIJ温度因子SITE特征位点SLTBRG盐桥SSBOND二硫键TURN转折TVECT转换因子ENDMDL亚基结束MODEL多亚基时，示亚基号TER链末端FORMUL非标准残基化学式HETATM非标准集团原子坐标HETNAM非标准残基化学名称CRYST1晶胞参数JRNL发表坐标集文件第84页PDB格式文件举例字段名称原子序号原子名称残基名称链标识符残基序号三维坐标空间大小温度因子原子名称第85页86SWISS-PdbViewer观察三维模型SWISS-PdbViewer工具/spdbv/第86页SW

33、ISS-PdbViewer主要功效（1）查看使用同源建模法预测蛋白质结构；（2）计算电荷分布，估算易受影响表面；（3）计算并显示不合理原子接触、氢键、角度；（4）人工编辑序列，如氨基酸突变、loop区域重建、旋转指定化学键，并经过能量最小化（energy minimization）调整修饰后蛋白质结构；（5）测量原子之间距离和角度；（6）利用Ramachandran plot观察蛋白质结构合理性。 第87页88菜单栏/工具栏图层窗口主窗口 序列联配窗口控制面板SWISS-PdbViewer 主界面第88页回到原始构象平移构象构象缩放构象旋转SWISS-PdbViewer 工具栏原子距离计算键角二面角显示范围中心显示原子信息第89页90Ramachandran图结构叠加第90页 二级结构预测面临困难:二级结构在不一样溶剂环境中构象可能会不一样同一肽段在不一样蛋白质中结构也不一样第91页（二）一些特殊结构预测信号肽、膜蛋白跨膜螺旋第92页信号肽：一些肽链N-末端存在着1530个氨基酸一段次序，其功效与将此蛋白质多肽链输送到细胞特定部位(细胞器)相关。1.信号肽预测：SignalP第93页第94页第95页结果输出每一aa给出位于01之间C，S，Y三个数值：（1）C-score（信号肽断