DNA甲基化与癌症

1、DNA甲基化与癌症.07.25第1页 表观遗传学与DNA甲基化 DNA甲基化检测伎俩 DNA甲基化与癌症第2页一、表观遗传学与DNA甲基化第3页第4页基因型相同现象1：一个生物体不一样组织基因表示模式截然不一样表示模式迥异第5页现象2：同卵双生孪生子含有完全相同基因组。但他们往往在长大成人后在性格、健康方面往往存在很大差异。第6页 现象3： 肿瘤抑制基因被过量地甲基化而造成失去活性，而基因DNA序列并不发生改变。 第7页现象4：橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相同，其实味不一样。同一个水果，在不一样产地生长，其味道，大小，外观可能相差很远。第8页Basket ball player？Sin

2、ger？President？TV host？假如他们出生在不一样地方第9页基因环境表型表观遗传学第10页相同基因型 不一样表型 ? 第11页 什么是表观遗传学？ 表观遗传学： 基因序列无改变 基因功效发生改变 可遗传而且是可逆 表观遗传学机制： DNA甲基化 组蛋白修饰 RNA调控（RNA干扰，microRNA, long non-coding RNA等)第12页表观遗传学/Epigenetics 基因型不变情况下，影响表型并能遗传现象，称为表观遗传或后生遗传。表观遗传学研究是在基因组DNA序列不变情况下，在表型上含有稳定、可遗传(或潜在可遗传性)改变。 定义Epigenetics - On

3、or over the genetic information encoded in the DNA第13页在细胞基因组上存在两类信息： A- 遗传学信息 B- 表观遗传学信息前者维持细胞活性功效工厂全部物质材料后者怎么建、何时建、在哪建附加信息基因组不但仅是序列包含遗传信息，而且其修饰也能够记载遗传信息。第14页DNA sequence codingEpigenetic programming表观遗传特点：广泛，多样，复杂第15页DNA甲基化 染色质重塑 RNA调控（RNA干扰， 非编码RNA:microRNA, long non-coding RNA等)表观遗传学当前主要研究发觉第16页细

4、胞命运个体发育疾病发生表观遗 传调控基因选 择表示表 观 遗 传 学基因表示前调控：DNA甲基化、基因印记、染色质重塑基因转录后调控：ncRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核糖开关RNA蛋白翻译后修饰：组蛋白甲基化和乙酰化、非组蛋白共价修饰第17页DNA甲基化组蛋白翻译后修饰RNA机制第18页甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移 到其他化合物过程,可形成各种甲 基化合物，或是对一些蛋白质或核 酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内，甲基化是经酶催化 ，这种甲基化包括基因表示调 控、蛋白质功效调整以及核糖核 酸(RNA)加工。甲 基 化第19页DNA 甲基化概

5、念及机理1950年，Wyatt在Nature上首次指出测序结果表明DNA可能存在第5碱基。DNA甲基转移酶： DNMT胞嘧啶： Cytosine5-甲基胞嘧啶： 5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAH第20页DNMTs活性甲基化合物DNA甲基化能够发生在腺嘌呤N-6位、 胞嘧啶N-4位、鸟嘌呤N-7位或胞嘧啶 C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主 要发生在5-CpG-3C上生成5-甲基胞嘧啶DNA甲基化（DNA methylation）DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMTs）作用下，将一个甲基添加在DNA分子中碱基上，最常见是加在

6、胞嘧啶上，由此形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。第21页DNA甲基化位点CpG岛或富含CpG岛区域CpG双核苷酸在人类基因组中分布很不均一，而在基因组一些区段，CpG保持 或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCC GGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCGGGGCCCTCCGGCG TCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGC

7、GCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCC CCGCGCGACCCGCTGCpG岛特征：A、CpG岛主要位于基因开启子区，部分位 于基因第一个外显子区； B、CpG岛甲基化能够直接造成相关基因表 观遗传学缄默。第22页高等生物基因组甲基化特点 1）广泛性 2）可遗传性 3）可逆性 4）组织特异性第23页CpG岛(CpG islands) 在结构基因5端附近调控区段， CG二联核苷经常以成簇串联形式排列，含量大于50%。 预测软件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html http:/www.ebi.a

8、c.uk/Tools/emboss/cpgplot/广泛性第24页可遗传性第25页DNA 修复基因表示调整癌基因代谢 凋亡分化细胞周期DNA甲基化DNA甲基化功效第26页DNA甲基化生物学意义DNA甲基化直接影响基因活化状态 DNA甲基化生物学意义在于： A、基因表示时空调控 B、保护基因组稳定性表现：基因在不一样时期不同身体部位特异表示I.有些基因在发育早期甲基化II.发育晚期被诱导去甲基化III.管家基因低甲基化IV.印记基因高甲基化第27页CpG甲基化与转录活性成反比CpG岛数目与基因密度相关人类基因组甲基化情况1%-2%人类基因组是CpG群人类基因组CpG岛约为28890个 平均值为每

9、Mb含10.5个CpG岛80%-90%CpG位点已被甲基化第28页一、DNA甲基化干扰转录因子对DNA元件识别与结合序列特异性甲基化DNA结合蛋白与开启子区甲基化CpG岛结合，募集组蛋白去乙酰化酶（HDAC）， 形成转录抑制复合物，阻止转录 因子与开启子区靶序列结合， 从而影响基因转录。DNA甲基化抑制基因转录机制没有甲基化基因表示基因开启子区域转录因子结合不能结合甲基化基因不表示甲基化第29页二、序列特异性甲基化DNA结合蛋白与开启子区甲基化CpG岛结合，募集组蛋白 去乙酰化酶（HDAC），形成转录抑制复合物，阻止转录因子与开启子区靶序列结 合，从而影响基因转录。DNA甲基化抑制基因转录机制

10、Sin3AMeCP2开启子基因转录因子基因表示开启子基因基因不表示第30页染色质构型改变伴随组蛋白乙酰化和去 乙酰化，以调控基因转录开关。DNA甲基化能引发染色质结构、DNA构象、 DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式 改变，从而控制基因表示。三、DNA甲基化经过改变染色质结构抑制基因表示DNA甲基化抑制基因转录机制第31页二、DNA甲基化检测伎俩第32页亚硫酸氢盐测序原理第33页1. 直接测序法第34页1. 直接测序法第35页 注： A：癌组织；B：癌旁组织；：未甲基化；：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43B2. 重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序第36页2.

11、 重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序第37页3. 甲基化特异性PCR 第38页3. 甲基化特异性PCR U M U M U M ladder100150200250MSP法检测抑癌基因RASSF1A开启子区甲基化图 MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。第39页4. 结合重亚硫酸盐限制性内切酶法第40页5. 基于限制性内切酶甲基化分析方法第41页6. 基于亲和纯化甲基化分析方法第42页三、DNA甲基化与癌症第43页DNA甲基化与癌症DNA甲基化与癌症发生发展有着亲密联络，DNA甲基化改变包含高甲基化和去（低）甲基化。对不一样肿瘤细胞D

12、NA分析表明，癌变细胞中出现基因突变概率要远远低于预期，与基因突变相比，DNA甲基化改变在细胞恶变过程中可能发挥了更大作用。第44页DNA甲基化与癌症发生发展有着亲密联络 高甲基化抑癌基因缄默 低甲基化原癌基因被激活CpG岛第45页抑癌基因高甲基化在肿瘤细胞中，抑癌基因开启子区域CpG岛处于高甲基化状态，因而抑癌基因缄默，使得细胞脱离正常细胞周期，进入肿瘤发生过程。 原癌基因激活正常细胞中，因为甲基化作用原癌基因多处于缄默状态，但在各种肿瘤细胞中，均发觉原癌基因处于低甲基化状态，而且低甲基化状态与其蛋白表示升高亲密相关，表明低甲基化状态可使原癌基因激活。第46页肿瘤细胞特征： 现在认为，肿瘤细

13、胞含有以下特征:1.逃避细胞死亡(resisting cell death)2.对生长抑制信号不敏感( evading growth suppressors )3.诱导新血管生成(inducing angiogenesis)4.无限复制潜能(enablingreplicative immortality)5.组织浸润和转移(activatinginvasion and metastasis)6.连续增殖信号(sustainingproliferative signaling) 另外，近年研究又提出了新两点:能量代谢改变(reprogramming of energymetabolism)和逃防

14、止疫系统破坏(evading immune destruction)以上几点在细胞发生癌变过程中有着主要意义.近年来研究发觉，特定基因DNA高甲基化在这些过程中均发挥主要作用.第47页1.逃避细胞死亡 通常情况下，细胞在接触抑制、辐射、凋亡信号分子等刺激时会发生凋亡，不过癌细胞却能够不受凋亡控制，而大量分裂增殖.比如，p53基因是一个主要抑癌基因，能够促使损伤细胞发生凋亡.50%癌症中存在p53基因突变失活. p53基因编码区甲基化状态轻易因为脱氨基作用发生5mC-T转换.同时，INK4a/ARF基因开启子区域甲基化能够使表示下降，造成原来受抑制MDM2表示上升，MDM2进而结合p53并使后者

15、发生蛋白质水平降解，使细胞逃避p53引发凋亡圈.DNA高甲基化与癌症第48页2.对生长抑制信号不敏感细胞生长抑制因子对细胞生长调控存在各种机制。在丙肝病毒感染肝细胞中，发觉了丙肝病毒关键蛋白(core protein)可引发p16基因开启子甲基化，p16表示水平下降从而促进了细胞分裂，在丙肝诱导肝癌中起着主要作用DNA高甲基化与癌症第49页3.诱导新血管生成新血管生成是癌症发生中主要步骤.新血管生成首先需要金属蛋白酶分解细胞外基质，再经过血管内皮生长因子来诱导血管生成。组织金属蛋白酶抑制剂能够抑制金属蛋白酶活性，同时与血管内皮生长因子结合阻止血管生成。肿瘤细胞中组织金属蛋白酶抑制剂下调有一部分

16、原因是因为开启子区域甲基化引发.血小管反应蛋白（TSP1）是另一个抑制血管生成蛋白，TSP1基因开启子区域甲基化引发基因表示抑制，进而造成肿瘤发生过程中细胞外基质重构和血管生成.DNA高甲基化与癌症第50页4.无限复制潜能癌细胞无限复制潜能主要与端粒酶活性升高相关。端粒酶能够利用RNA逆转录DNA，处理DNA复制时末端缺失问题。正常情况下端粒酶只有在受精卵和十细胞中才有活性，而肿瘤细胞大多含有高活性端粒酶。端粒酶主要组成部分是人端粒酶逆转录酶。它活性与端粒酶活性高度相关. 引发人端粒酶逆转录酶激活开启子甲基化有位置特异性，即与开启子特定部位甲基化及相关区域整体非甲基化相关。DNA高甲基化与癌症

17、第51页5.组织浸润和转移组织浸润和转移是细胞恶变主要特征，近年来这力一面研究进展快速.细胞骨架异常调整与肿瘤转移亲密相关。DFNAS是一个新发觉乳腺癌相关基因.DFNAS能够促进细胞凋亡，而DFNA基因开启子甲基化后表示抑制造成了肿瘤细胞转移几率增大DNA高甲基化与癌症第52页6.连续增殖信号大部分癌细胞不需要外界生长刺激因子作用就能够完成增殖，原因是细胞内信号转导通路发生了改变，造成促增殖因子作用增强。在结直肠癌中发觉肿瘤干细胞中SFRPs开启子区域高甲基化使其表示抑制，引发了Wnt通路过分激活而刺激细胞分裂，因而细胞在不需要外界生长刺激因子作用下就能够不停增殖。DNA高甲基化与癌症第53

18、页与癌症发生过程中DNA甲基化不一样，DNA低甲基化既包含特定基因(主要是原癌基因)低甲基化，还包含基因组范围内以非编码重复序列为主DNA整体水平低甲基化.DNA低甲基化与癌症第54页1. 特定基因甲基化水平降低CT ( cancer/testis antigen genes)抗原属于MACE ( melanoma and germ cell expressed)基因家族，正常情况下只在生殖细胞表示。CT抗原在各种肿瘤组织中高表示，如肺癌，胰腺癌，胃癌等。CT激活与它开启子区域去甲基化相关。近年来，白血病基因，乳腺癌基因，结肠直肠癌，肾细胞癌基因肝癌基因中都发觉了由开启子低甲基化所引发肿瘤相关

19、基因过表示.DNA低甲基化与癌症第55页2.基因组范围整体DNA甲基化降低基因组范围DNA甲基化程度能够经过甲基化敏感DNA酶来检测。在各种癌症当中都发觉了基因组范围整体水平DNA甲基化降低，包含许多重复序列甲基化水平下降。正常组织细胞甲基胞嘧啶含量约4%，而癌细胞则为大约2%一3%。DNA甲基化水平降低能够出现在肿瘤发生早期阶段。肿瘤细胞在基因缺乏区域(gene-poor areas)DNA甲基化水平显著下降，而基因开启子区域甲基化差异则相对较小，提醒这些非编码区域甲基化水平降低可能与肿瘤发生有更亲密关系.DNA低甲基化与癌症第56页DNA甲基化与癌症诊疗表观遗传学改变是细胞癌变主要特征之一

20、，所以，细胞DNA甲基化改变能够作为癌症早期诊疗主要依据。甲基化生物标识不停发觉使这一技术在临床应用成为可能。 甲基化特异PCR技术(methylation-specific PCR MSP)出现，使得细胞DNA甲基化水平检测变得十分方便。DNA甲基化检测稳定性好，有组织特异性，易于检测且其异常程度常与癌症进展相关.所以，相对于传统基因突变检测有很大优势。在许多癌症中都己经发觉了癌症相关基因甲基化水平改变，如外周血细胞DNA低甲基化与膀胱癌发生亲密相关，伴随全基因组甲基化图谱绘制，相信会有更多甲基化生物标识投入到临床癌症诊疗中。第57页与基因突变不一样，表观遗传学改变大都是可逆，所以，利用药品来改变细胞表观遗传学状态可能是治疗癌症一条新路径。当前甲基化酶抑制剂主要有zebularine和 5-ADC 。 5-ADC在试验中显示了对骨髓增生症、白血病和实体肿瘤都有显著疗效。Zebularine在小鼠肠癌模型中能够显著降低息肉数量。其它甲基化抑制剂如RG-108，EGCG等在试验中均表现出了对肿瘤抑制作用。DNA甲基化