酶工程绪论课件

1、1酶工程生物技术的四大支柱蛋白质工程抗体工程糖链工程海洋生物技术生物转化2核心和关键是主导技术基 础条 件获得产物的手段第二代基因工程第三代生物技术衍生工程技术3基因工程：用“剪刀+糨糊”创造新物种的工程。细胞工程：有生命的微型加工厂。酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工 厂，将神话变为现实的桥梁。5化学酶工程（初级酶工程） 酶化学与化学工程技术相结合的产物。 主要研究内容：酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。2. 生物酶工程（高级酶工程） 在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物

2、。 6生物酶工程示意图酶的蛋白质结构功能新酶分子蓝图选择性修饰方案突变酶 新酶克隆酶产品效用发展酶基因遗传设计遗传修饰DNA重组技术DNA重组技术7 生物酶工程主要研究内容（1） 用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）如：尿激酶原和尿激酶是治疗血栓病的有效药物。用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因转移到大肠杆菌中，可使大肠杆菌细胞生产人尿激酶原，从而取代从大量的人尿中提取尿激酶。（2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶）如：酪氨酰tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的丝氨酸），使该酶对底物ATP的亲和力提高了100倍。（3）设计新的酶结构基因，生产自然界从

3、未有过的性能稳定、活性更高的新酶。8酶工程内容 1971年第一届国际酶工程会议，将酶生产与应用确认为酶工程核心内容：（1）酶的产生（天然酶的开发和生产）；（2）酶的分离纯化及鉴定技术；（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶分子的定向改造与修饰（5）酶反应器的研制和应用；（6）酶的应用。10人们对酶的认识起源于生产与生活实践。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。公元前12世纪周朝，制作饴糖和酱。春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。酶者，酒母也二、酶工程研究历史与现状不自觉的应用：酿酒、造酱、制饴糖、治病酶学的产生: 消化与发酵现象（一）酶学研究简史12发酵1684年，比利时医生He

4、lment提出 ferment引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）。1833年，法国化学家Payen (佩恩)和Person(帕索兹) 用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶（diastase）。1878年，德国科学家Khne(库尼)提出 enzyme从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。14Buchner试验： 用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液不含活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二氧化碳。证明：发酵与细胞的活动无关。1516 酶活细胞产生的，能在细胞内外起作用的（催化）生理活性物质。enzymeorganic chemical substance (a catalyst) fo

5、rmed in living cells, able to cause changes in other substance without being changed itself. 酶的化学本质？17 酶学的迅速发展（理论研究）（1） 酶的化学本质1926年,美国康乃尔大学的“独臂学者” Sumner（萨姆纳）博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质。并获得1947年的诺贝尔奖。1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶（pepsin）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）结晶，确立了酶的化学本质。1820（2） 酶学理论研究1

6、890年，Fisher锁钥学说。1902年，Henri中间产物学说。1913年， Michaelis 和 Menten米氏学说。1958年， Koshland诱导契合学说。1960年，Jacob 和 Monod操纵子学说。21 酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊蛋白质。 是否所有的酶都是蛋白质？ 1982年，Thomas R.Cech(切克)等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶Ribozyme。 1986年，Schultz 等以过渡态类似物为半抗原，获得了具有催化活性的抗体，即抗体酶（abzyme）23（二) 酶工

7、程研究简史（应用研究）1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备得到淀粉酶，开创了酶技术走向商业化的先例。1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，用于皮革的软化及洗涤。1908年，法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的褪浆。1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。 20世纪前几十年，酶蛋白的研究技术没有突破，酶工程研究进展缓慢。24 第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发酵工业和设备的渐渐完善，利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规模化产业，并开辟了广阔的市场。 26自然酶在工业应用上受到限制的原因主要有：大多数酶脱离其生理环境后极不稳定，

8、而酶在生产和应用过程中的条件往往与其生理环境相去甚远；酶的分离纯化工艺复杂；酶制剂成本较高27固定化酶较自由酶具有很多优点：稳定性高；酶可反复使用；产物纯度高，副产物少，从而有利提纯；生产可连续化、自动化；设备小型化，节约能源等。28固定化酶的基础上逐渐发展固定化细胞技术近年来，后来居上的固定化细胞技术发展更为迅速，在实际应用方面已大大超过固定化酶。在工业应用方面，利用固定化酵母细胞发酵生产酒精、啤酒的研究较引入注目。日本Toshio Onaka 等用海藻酸钙凝胶包埋酵母细胞，可在一天内获得质量优良的啤酒。法国Corriell 等将酵母细胞固定在聚氯乙烯碎片和多孔砖等载体上进行啤酒发酵中型试验

9、，可连续运转8个月。中国上海工业微生物研究所等单位也从20世纪70年代后期进行过类似的研究工作，用固定化酵母发酵啤酒的规模不断扩大，已正式投入大规模生产。 10因此固定化酶研究仍是酶工程研究的中心304 通常将改变酶蛋白一级结构的过程称为改造，而将酶蛋白侧链基团的共价变化称为修饰。 酶分子经加工改造后，可导致有利于应用的许多重要性质与功能的变化。如德重等利用蛋白水解酶的有限水解作用，已将L-天冬氨酸酶的活力提高36倍。 美国Davis等人还利用蛋白质侧链基团的修饰作用，研究降低或解除异体蛋白的抗原性及免疫原性。以聚乙二醇修饰治疗白血病的特效药L-天冬酰胺酶，使其抗原性完全解除。1131 基因工

10、程与酶工程相结合 1980年，Wagner等人报道，将大肠杆菌ACTT11105的青霉素酰化酶基因克隆到质粒上，获得产酶活力更高的大肠杆菌5K(PHMl2)杂交株，并将此大肠杆菌杂交株固定，用于生产青霉素酰化酶。这是基因工程与酶工程相结合的第一例。 近年来，有关藻类等各种植物细胞、原生动物等各种动物细胞固定化研究十分活跃。1980年，Lim和Sun报道，用海藻酸钙包埋胰岛细胞可用于大白鼠糖尿病的治疗研究。32 20世纪90年代，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此 “基因工程发酵工艺先进的发酵

11、设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。 33 从酶工程的进展和动态中可以预料，今后将会出现一批基因工程表达的酶制剂，亲和层析技术仍将得到广泛应用，并会出现一个应用经分子改造与修饰的酶制剂的热潮。异体酶的抗原性将得到解决。在酶活性的控制方面将会有较大突破，其中酶抑制剂与激活剂仍将受到极大重视，并在临床及工农业生产中发挥重要作用。在化学合成工业中，酶法生产将有重大贡献，模拟酶、酶的人工设计合成、抗体酶、杂交酶将成为活跃的研究领域。非水系统酶反应技术(反向胶束中的酶促反应、有机溶剂中的酶反应)也仍将是研究热点之一。1334三、酶工程现代生物技术领域中的地位 其应用范围越来越广。除应用于传统的食品工业(乳

12、糖的分解、乳酪制造、牛奶消毒、酒精生产等)外，在其他领域如工业催化剂、分析化学、医疗、筛选活性物质、新能源、污水处理、亲和层析等也获得广泛应用。35“绿色健康”，“酶”力无限医药、洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、饲料、皮革、造纸和化工等工业领域 酶工程在现代生物技术领域中的地位361、酶在医药方面的应用2、酶在食品方面的应用3、酶在轻工、化工方面的应用 4、酶在环境保护中的应用GoGoGoGo5、酶在生物技术方面的应用Go37酶在医药方面的应用用酶进行疾病的诊断用酶进行疾病的治疗用酶制造各种药物381-1 通过酶活力

13、变化进行疾病诊断酶疾病与酶活力变化淀粉酶胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降胆碱酯酶肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等，活力下降酸性磷酸酶前列腺癌、肝炎、红血球病变时，活力升高碱性磷酸酶佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时，活力升高；软骨发育不全等，活力下降谷丙转氨酶/谷草转氨酶肝病、心肌梗塞等，活力升高-谷氨酰转肽酶（-GT）原发性和继发性肝癌，活力增高至200单位以上，阻塞性黄疸、肝硬化、胆道癌等，血清中酶活力升高醛縮酶急性传染性肝炎、心肌梗塞，血清中酶活力显著升高胃蛋白酶胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降磷酸葡糖变位酶肝炎、癌症，活力升高乳酸脱氢酶肝癌、急性肝炎、心肌梗塞，活力显

14、著升高；肝硬化，活力正常端粒酶癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性山梨醇脱氢酶（SDH）急性肝炎，活力显著提高脂肪酶急性胰腺炎，活力明显增高，胰腺癌、胆管炎患者，活力升高肌酸磷酸激酶（CK）心肌梗塞，活力显著升高；肌炎、肌肉创伤，活力升高羟基丁酸脱氢酶心肌梗塞、心肌炎，活力增高磷酸己糖异构酶急性肝炎，活力极度升高；心肌梗塞、急性肾炎，脑溢血，活力明显升高鸟氨酸氨基甲酰转移酶急性肝炎，活力急速增高；肝癌，活力明显升高乳酸脱氢酶同工酶心肌梗塞、恶性贫血，LDH1增高；白血病、肌肉萎缩，LDH2增高；白血病、淋巴肉瘤、肺癌，LDH3增高；转移性肝癌、结肠癌，LDH4增高；肝炎、原发性肝癌、

15、脂肪肝、心肌梗塞、外伤、骨折，LDH5增高葡萄糖氧化酶测定血糖含量，诊断糖尿病亮氨酸氨肽酶（LAP）肝癌、阴道癌、阻塞性黄疸，活力明显升高391-2 用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断 酶测定的物质用 途葡萄糖氧化酶葡萄糖测定血糖、尿糖，诊断糖尿病葡萄糖氧化酶+过氧化物酶葡萄糖测定血糖、尿糖，诊断糖尿病尿素酶尿素测定血液、尿液中尿素的量，诊断肝脏、肾脏病变谷氨酰胺酶谷氨酰胺测定脑脊液中谷氨酰胺的量，诊断肝昏迷、肝硬化胆固醇氧化酶胆固醇测定胆固醇含量，诊断高血脂等DNA聚合酶基因通过基因扩增，基因测序，诊断基因变异、检测癌基因402 酶在疾病治疗方面的应用酶 名来 源用 途淀粉酶胰脏、麦芽、微生

16、物治疗消化不良，食欲不振蛋白酶胰脏、胃、植物、微生物治疗消化不良，食欲不振，消炎，消肿，除去坏死组织，促进创伤愈合，降低血压脂肪酶胰脏、微生物治疗消化不良，食欲不振纤维素酶霉菌治疗消化不良，食欲不振溶菌酶蛋清、细菌治疗各种细菌性和病毒性疾病尿激酶人尿治疗心肌梗塞，结膜下出血，黄斑部出血链激酶链球菌治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折青霉素酶蜡状芽孢杆菌治疗青霉素引起的变态反应L-天冬酰胺酶大肠杆菌治疗白血病超氧化物歧化酶微生物，植物，动物预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎凝血酶动物，蛇，细菌，酵母等治疗各种出血病胶原酶细菌分解胶原，消炎，化脓，脱痂，治疗溃疡右旋糖酐酶微生物预防龋

17、齿 胆碱酯酶细菌治疗皮肤病，支气管炎，气喘溶纤酶蚯蚓溶血栓弹性蛋白酶胰脏治疗动脉硬化，降血脂核糖核酸酶胰脏抗感染，祛痰，治肝癌尿酸酶牛肾治疗痛风41溶菌酶423 酶在药物制造方面的应用 酶主要来源用途青霉素酰化酶微生物制造半合成青霉素和头孢菌素11-羟化酶霉菌制造氢化可的松L-酪氨酸转氨酶细菌制造多巴（L-二羟苯丙氨酸）-酪氨酸酶植物制造多巴-甘露糖苷酶链霉菌制造高效链霉素核苷磷酸化酶微生物生产阿拉伯糖腺嘌呤核苷（阿糖腺苷）酰基氨基酸水解酶微生物生产L-氨基酸5-磷酸二酯酶桔青霉等微生物生产各种核苷酸多核苷酸磷酸化酶微生物生产聚肌胞，聚肌苷酸无色杆菌蛋白酶细菌由猪胰岛素（Ala-30）转变为人

18、胰岛素（Thr-30）核糖核酸酶微生物生产核苷酸蛋白酶动物、植物、微生物生产L-氨基酸-葡萄糖苷酶黑曲霉等微生物生产人参皂甙-Rh243乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酰 -D AlaAminoacylase 氨 基 酰 化 酶44青霉素酰化酶与抗生素改造45淀粉酶类与淀粉糖业酶在食品方面的应用46果汁生产与果胶酶乳制品与凝乳酶47酶在轻工、化工方面的应用 用酶进行原料处理用酶生产各种轻工、化工产品用酶增强产品的使用效果。 48酶水解了毛根部的毛囊蛋白而使毛松动脱落。蛋白酶分解皮纤维间质中的可溶性蛋白质，使皮纤维进一步松散软化。加速蛋白质的分解染色温度降低皮革脱毛与软化加酶洗涤剂生丝

19、脱胶与羊毛染色蛋白酶回本章目录49生物抛光是一种用纤维素酶改善纤维素纤维制品表面的整理工艺,以达到持久的抗起毛起球并增加织物的光洁度和柔软度 50SOD51酶在环境保护中的应用环境监测废水处理过氧化物酶多酚氧化酶可降解材料开发52酶在生物技术方面的应用除去细胞壁大分子切割大分子连接53 现代基因工程的创始人P伯格（美国,1926）在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。 54 目的基因基因载体重组体分切接转筛55DNA 连接酶 “分子针线”限制性内切酶 “分子手术刀 ”限制性酶活性缓冲液甲基化底物性状56 一些限制性核酸内切酶的来源与作用位点酶识别序列与作用位点53来 源Alu AGCTArthr