动物细胞工程制药 (3)讲稿

1、关于动物细胞工程制药 (3)第一张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月Robert Hooke 及其制作的显微镜第一节 概述第二张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月Leeuwenhoek首次观察到了活的细胞第三张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann创立了细胞学说1885年Roux用生理盐水成功培养鸡胚组织1907年Harrison成功培养了离体的蛙胚神经组织，并观察到神经细胞突起的生长过程。开创现代细胞培养的新纪元。第四张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物

2、学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。第五张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月二、动物细胞的化学组成和代谢动物细胞的化学组成 无机成分：水、无机盐 有机成分：蛋白质、糖类、脂类、核酸动物细胞的代谢 糖，脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段（大分子降解为小分子，小分子代谢产生三个主要的中间产物，中间产物进入三羧酸循环）第六张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月三、动物细胞的生理特点细胞的分

3、裂周期长：一般1248 h细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象接触抑制现象：指细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂的现象。正常二倍体细胞的生长寿命是有限的:时间长短决定于细胞来源的种族和年龄 原代培养 有限细胞系 无限细胞系（连续细胞系）第七张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月动物细胞对周围环境十分敏感 对理化因素敏感：如渗透压、pH、离子强度、剪切力、微量元素等。动物细胞对培养基的要求高 必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 第八张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月动物细胞生产药物缺点：

4、培养条件高、成本贵、产量低优点：分泌胞外、收集纯化方便，较完善的翻译后修饰，与天然产品一致第九张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月第三节 生产用动物细胞的要求和获得一、生产用动物细胞的要求二、生产动物细胞的获得三、基因工程细胞的构建和筛选四、常用生产用动物细胞的特性五、细胞库的建立第十张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月一、生产用动物细胞的要求只有从正常组织中分离的原代细胞才能用来生产生物制品，如鸡胚细胞、兔肾细胞等二倍体细胞，即使经过多次传代也可用于生产，如WI-38，2BS细胞等用异倍体传代细胞生产重组基因产品，如t-PA、EPO、因子等按照FDA对细胞株的要求，控制最

5、终产品中DNA残留量第十一张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月二、生产用动物细胞的获得原代细胞：直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。如鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、淋巴细胞等用原代细胞生产生物制品常需要大量的动物，费钱费力第十二张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株由于该类细胞寿命有限，一般从动物的胚胎组织中获取。如WI-38、MRC-5、2BS等第十三张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月转化细胞系：失去了正常细胞的特点，获得了无限增殖的能力

6、转化细胞系具有无限生命力，常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，更适于大规模工业化生产。如Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞等第十四张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月融合细胞系细胞融合：指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程目前常用的融合方法有：仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法第十五张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月仙台病毒融合法（很少使用）融合过程：病毒加入两种细胞（4），附膜，细胞凝聚37，病毒与细胞膜反应，细胞膜被破坏两细胞连接部穿通，周边连接部修复细胞融合第十六张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月聚乙二醇（PEG

7、）融合法常用相对分子量为1000，浓度为50%，pH在8.08.2时融合率可达100%目前主要用于产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备第十七张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月电融合法：在短时间的强电场作用下，细胞膜发生可逆性的电击穿，使相邻细胞的细胞膜发生继发性融合。优点：操作简单，无化学毒性、对细胞损伤小、融合同步、融合率高，可在显微镜下直接观察决定因素：电场强度、脉冲宽度、温度、缓冲液的性质（pH、离子强度、渗透压）第十八张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月重组工程细胞系可采用基因工程的手段构建各种工程细胞第十九张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月三、基因工程细

8、胞的构建和筛选1.真核细胞基因表达载体的构建病毒载体：如牛痘病毒、腺病毒、反转率病毒、杆 状病毒等质粒载体：穿梭质粒载体第二十张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月用杆状病毒做载体的优点该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组；插入78kb的DNA不影响正常病毒粒子的形成；多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的2030%；用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选阳性克隆；如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。第二十一张，PPT共一百一十二页，创作于2

9、022年6月构建质粒载体一般含有如下基本成分： 允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。含有能使基因转录表达的调控元件。 能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。仅适用于密切相关的突变细胞株，如tk基因显性作用基因，如neo基因 有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。第二十二张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选 融合法 化学法 物理法 病毒法细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法 重组逆转录病毒介导法 脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 显微注射法 重组DNA病毒介导法 原生质融合法 染色体介导法 基因枪法 多瘤病毒样颗粒介导法 微细胞介导法鬼影

10、红细胞介导法DNA导入动物细胞的常用方法第二十三张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月磷酸钙沉淀法：将溶解的DNA加在Na2HPO4中，逐渐加入CaCl2溶液，当 Na2HPO4和CaCl2形成沉淀，DNA包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉淀物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用将DNA导入胞内。优点：方法简单，可进行共转化第二十四张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月电穿孔法：借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。特点：转化效率较高，但进入的DNA拷贝数较低第二十五张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月如何筛选工

11、程细胞？依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统：如用HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞；用G418（Geneticin）选择系统，筛选neor的转化细胞。对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。利用扩增系统，不断增加其基因拷贝数，获得高效表达而稳定的工程细胞株。第二十六张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月四、常用生产用细胞的特性（1）WI-38： 1961年来源于女性高加索人正常胚肺组织的二倍体细胞系。 该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME（Eagles basal medium）加小牛血清，pH控制在7.2。细胞的倍增时间

12、为24h，有限寿命为50代，上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。第二十七张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月（2）BHK-21： 1961年从5只生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。现在广泛采用的是1963年用单细胞分离的方法经13次的克隆的细胞。 成纤维细胞，2n=44。通常用的培养基为DMEM培养基，添加7%胎牛血清。过去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，现在已被用于构建工程细胞。第二十八张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月（3）Vero： 1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。 是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高倍体率为1.7%，可持续地进行培养。

13、通常用的培养基为199培养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被批准用于人体。第二十九张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月（4）Namalwa： 1972年来源于肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的病人体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞。 该细胞有2.8%的高倍体率，多数细胞有1214条标记染色体，单条X染色体，无Y染色体。通常用的培养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于大规模生产-干扰素。第三十张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月五、细胞库的建立用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：1. 原始细胞库（master c

14、ell bank， MCB）2. 生产用细胞库（manugactures working cell bank，MWCB），或称工作细胞库（working cell bank， WCB）。第三十一张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月原始细胞库是单一来源的均质的细胞，对于二倍体细胞应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。贮存时须有该细胞的详细档案，包括：该细胞系的历史：来源、年龄和性别、细胞分离的方法、所用的培养材料等；该细胞系的特性：形态、生长的特性、种源的特性等；对各种有害因子检查的结果。第三十二张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月生产用细胞库：从原始细胞库来，或从单一安瓿来，或

15、从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然后经培养扩增到一定数量后，再分装储存形成的细胞库。生产用细胞库也必须建立档案，而且需要进行无菌性和无细胞交叉污染的检查，生产时需确定其最高使用的传代数。第三十三张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月第四节 动物细胞的培养条件和培养基培养成功必备条件：所有与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免即使是极微量的有害离子的掺入保证有适量的氧气供应需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物有良好的适于生存的外界环境及时分种，保持合适的细胞密度第三十四张，PPT共一百一十二页，创作于20

16、22年6月一、动物细胞的培养条件器材的清洗和消毒水质pH渗透压温度空气第三十五张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月1. 器材的清洗和消毒（1）器材的清洗：浸泡（3%磷酸三钠）刷洗泡酸（重铬酸钾、硫酸、水）冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水）（2）器材的消毒灭菌： 物理方法：如紫外线、干热、湿热、过滤 化学方法：如化学消毒剂、抗生素第三十六张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月2. 水质细胞培养的水必须进行特殊的处理，才能使用。除微生物、有毒元素、金属离子、热原质当前处理水质的方法有：蒸馏、离子交换、电渗透、反渗透、中空纤维过滤等第三十七张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6

17、月3. pH动物细胞培养的最适pH为7.27.4，低于6.8或高于7.6会对细胞产生不利影响，严重时可引起细胞退变甚至死亡。培养基应具有一定的缓冲能力，必须加入缓冲系统： 如HEPES、 Na2HPO4/ NaH2PO4缓冲系统、 NaHCO3/CO2缓冲系统等第三十八张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月4. 渗透压细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。最理想的渗透压为290300mOsm/kg为调整培养液的渗透压，一般采用加减NaCl的方法： 1mg/ml NaCl-32mOsm/kg在细胞培养操作中，为保持合适的渗透压和pH，一般都使用平衡盐溶液（BBS）

18、，由无机盐和葡萄糖组成。第三十九张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月5. 温度动物细胞最佳培养温度：370.5昆虫细胞最佳培养温度：27 温度过高：细胞退变甚至死亡温度过低：降低代谢和生长速度，影响产量第四十张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月6. 空气方瓶和转瓶培养时，保持瓶内有足够的空间，即培养的液体量不超过总体积的30%。采用生物反应器需通气，采用不同比例的O2、N2、CO2和空气。第四十一张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月无毒、无污染体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有任何抵抗能力，因此培养基应达到：无化学物质污染无微生物污染（如细菌、真菌、支原

19、体、病毒等）无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作对于合成培养基，污染主要来源于配置过程，配制所用的水、器皿应十分洁净，配置后应严格过滤除菌。第四十二张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月二、动物细胞培养基的种类和组成1.天然培养基指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。缺点：成分复杂，制作过程复杂，组分不稳定，批间差异大，来源有限，不适于大量培养和生产的需要，逐渐为合成培养基所替代。第四十三张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月

20、2.合成培养基优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应其组成大致如下：氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必需氨基酸：缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。 此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。第四十四张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月维生素：主要是形成酶的辅酶、辅基，维持细胞生命活动的低分子活性物质。脂溶性（A、D、E、K），水溶性维生素（C、B1、B2、B12、生物素、叶酸、胆碱）等都是常用的成分。糖类:培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主

21、要能源。此外六碳糖也是也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。第四十五张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月无机盐：保持细胞的渗透压，缓冲pH的变化，并积极参与细胞的代谢。细胞生长除需Na、K、Ca、Mg、N、P等基本元素，还需要Fe、Cu、Zn、Mn等微量元素。其它成分：有些合成培养基中还加有核酸的前体、氧化还原剂等。一般都需要加入510%的小牛血清。 除了以上与细胞生长有关的物质以外，培养基中一般还要加入一种pH指示剂酚红。当溶液酸性时pH6.8呈黄色，当溶液碱性时pH8.4呈红色。第四十六张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月血清的主

22、要成分血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等第四十七张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月血清的种类小牛血清：取自出生10-30天的小牛新牛血清：取自出生24h之内的新生牛胎牛血清：取自剖腹产的胎牛，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。第四十八张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月血清的外观好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。如血清浑浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性。若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象。摇晃时感觉液体

23、稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。第四十九张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月血清的作用机制提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素提供良好的pH缓冲系统第五十张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月3.无血清培养基优点：提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响；减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；供应充足、稳定；细胞产品容易纯化；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验

24、结果的分析。第五十一张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月无血清培养基：合成培养基+不同种类的添加剂添加剂大致有以下几类：激素和生长因子： 各种激素、生长因子的功能 维持细胞的功能 保持细胞的状态（分化或未分化） 使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞生长有刺激作用。无血清培养基第五十二张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月结合蛋白：最经常被补充的是铁传递蛋白和白蛋白。为了便于纯化，有时可用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁代替铁传递蛋白。贴附和伸展因子：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞的很少，也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子。

25、除贴附因子（纤维结合蛋白、胶原）、多肽生长因子，有的还添加维生素A酸和重组的小肽，它可与细胞的受体结合。其它有利于细胞生长的因子和元素：它们包括有消除氧自由基损害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。第五十三张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月如何选择培养基选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法。第五十四张，PPT共一百

26、一十二页，创作于2022年6月培养细胞的种类： 原代细胞培养 传代细胞培养培养基不同： 液体培养 固体培养培养容器和方式不同： 静止培养 旋转培养 微载体培养 中空纤维培养 固定化培养第五节 动物细胞培养的基本方法第五十五张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月一、细胞分离离心分离法：主要用于从含有细胞的体液，如血液、羊水、胸腹水中分离细胞，8001000 r/min离心510min消化分离法：将生物体的组织块剪碎-用消化液消化，使组织松散成细胞悬液-用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液-获得所需细胞第五十六张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月消化液的用途：取材进行原代培养时需

27、要将组织块消化解离形成细胞悬液；传代培养时将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。常用的消化液:胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶、链酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等第五十七张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月二、细胞计数自动细胞计数器计数原理：让一定体积的细胞悬液流经一个小孔，并在两个电极间通过，此时通过的细胞就会对电极间的电流产生干扰而使电压发生改变，这样就会在电子计数器上形成一个信号被记录下来。优点：计数速度快缺点：无法分辨活细胞和死细胞，误将细胞结团记录为单个细胞，使计数值偏低第五十八张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月血球计数板计数第五十九张，P

28、PT共一百一十二页，创作于2022年6月2.血球计数板计数台酚蓝染色：死细胞呈蓝色苯胺黑染色：负染色法，细胞本身不染色第六十张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月结晶紫染色细胞核计数法原理：结晶紫染液属碱性染料，低渗，有螯合钙离子的作用，可使细胞分散解离和破碎，将细胞核染成蓝色。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即细胞数。第六十一张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月MTT染色计数法MTT:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 原理：活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不可溶性的紫色的甲臜结晶，可溶于二甲亚砜（D

29、MSO）。 MTT结晶形成的量与细胞数成正比。用酶标仪在490nm处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。灵敏度高；MTT有致癌性，DMSO极易渗透皮肤第六十二张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月三、细胞传代悬浮细胞的传代：加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶贴壁细胞的传代：先消化再分种第六十三张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月贴壁细胞传代的注意事项消化前确定细胞有无污染加入消化液量要适当，摇动时能盖满单层细胞即可消化时间不宜过长，室温静置2-5min终止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培养基分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数以20-30万个/ml，每次1

30、传2或1传3为宜；已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过2-3次二倍体细胞每次传代时应写上传代次数传代后每天或隔一天换液，3-5d传代一次第六十四张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月四、细胞的冻存和复苏1.细胞的冻存采用液氮低温（-196）冻存：加保护剂如甘油和二甲亚砜；冷冻速度以1/min的速度下降为宜注意事项：冻存前一天换液培养；细胞密度以1-2106个/ml为宜；冻存用培养基应与实际使用的一致，DMSO过滤除菌；检查安踣的密封性；标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。第六十五张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月2.细胞的复苏（总的要求是快融）注意事项：操作中注意防护，戴面

31、罩和手套；从液氮中取出后，立即丢入37-40温水的搪瓷杯中，并搅动加速融化；用乙醇消毒安踣外表；尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液；隔天观察细胞生长情况，再换液一次。第六十六张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月一、动物细胞大规模培养的方法二、动物细胞培养的操作方式第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式第六十七张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月一、动物细胞大规模培养的方法依细胞种类： 原代培养 传代培养依培养基： 液体培养 固体培养第六十八张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月依培养容器和方式： 静止培养、旋转培养、 搅拌培养、微载体培养 中空纤维培养、 固定床

32、或流化床培养第六十九张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月从生产实际分为： 悬浮培养 贴壁培养 贴壁-悬浮培养第七十张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月1.悬浮培养悬浮培养：即让细胞自由地悬浮于培养基内生长繁殖。适用 于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞）， 也适用于兼性贴壁细胞。优点：操作简便，培养条件比较单一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴细菌发酵的经验；可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害；细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。缺点：细胞体积较小，较难采用

33、灌流培养，细胞密度较低第七十一张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，需采用搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及一定速度通入含5%CO2的无菌空气，保持细胞悬浮状态并维持培养液溶解氧和pH。不同细胞悬浮条件不同。为使细胞不致凝集、成团或沉淀，在配制培养基的基础盐溶液中不加钙和镁离子。间歇或连续更换部分培养液，可维持pH值，若使用HEPES缓冲盐溶液可不必连续通入含5%CO2的空气。第七十二张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月2.贴壁培养贴壁培养：是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁 殖的培养方法。适用于一切贴壁依赖性 细胞，也适用于兼性

34、贴壁细胞。优点：适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养缺点：操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，传代或扩大培养时需先消化，培养条件不易均一，传质和传氧较差。第七十三张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月3.贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）微载体培养包埋和微囊培养结团培养第七十四张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月（1）微载体培养微载体培养法：将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法，或称微珠培养法。制备微载体的材料主要有： 葡聚糖 明胶 玻璃 纤维素等第七十五张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月微载体培养的优点：既可创

35、造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的基本要求，又由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。第七十六张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月理想微载体需具备的条件微载体表面性质与细胞有良好的相容性；微载体的材料无毒性；微载体的材料是惰性材料；材料比重为1.030-1.045g/ml；粒径60-250m（溶胀后），大小均一；具有好的光学透明性；基质的性质是软性的；可耐120高温，便于采用高压蒸汽灭菌原料充分，制作简便，价格低廉，可反复使用第七十七张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月从固体微载体发展到多孔

36、微载体（porous microcarrier）或多孔微球：极大增大了供细胞贴附的比表面积，同时适用于悬浮细胞的培养。第七十八张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月（2）包埋和微囊培养包埋法：将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中微囊法：由包埋法衍生而来，将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊可用于包埋细胞的载体材料：人工合成的高分子聚合物（聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等）、糖类（如纤维素、琼脂、琼脂糖、K-卡拉胶、海藻酸钙、壳聚糖等）、蛋白质（如胶原、明胶、纤维蛋白等）第七十九张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月包埋或微囊培养法的优点包埋或包裹在载体

37、或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害。可以获得较高的细胞密度，一般都在107-108个/ml以上。当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。可采用多种生物反应器进行大规模培养。第八十张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月（3）结团培养利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法培养，可获得高密度的细胞。优点：操作简便，节省了用于微载体的成本第八十一张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月二、动物细胞培养的操作方式分批式操作补料-分批（或流加式）操作（细菌生产中常用）半连续式操作连续式操作（个别情况下用于悬浮细胞的培养）灌流式操作第八十二张，

38、PPT共一百一十二页，创作于2022年6月1.分批式操作将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。第八十三张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月2.半连续式操作定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。优点

39、：操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。第八十四张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月3.灌流式操作定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。第八十五张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月细胞可处在较稳定的良好的环境中，营养条件好，有害代谢废物浓度低；可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量；产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；培养基的比消耗率较低，加

40、之产量质量的提高，生产成本明显降低。灌流式操作的优点第八十六张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月一、动物细胞生物反应器的类型二、动物细胞生物反应器的检测控制系统第七节 动物细胞生物反应器第八十七张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月生物反应器必备条件制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物的污染对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精确度高，能保持环境质量的均一第八十八张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6

41、月可长期连续运转容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒，便于操作维修设备成本尽可能低生物反应器必备条件第八十九张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月按规模大小可分为：实验室规模：20L，用于培养工艺的研究;中试规模：20100L，提供一定量的产品，供纯化、临床前的各种检测和临床观察，也包括进一步的工艺优化实验;生产规模：100L，用于生产，提供产品。动物生物反应器第九十张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月一、动物细胞生物反应器的类型搅拌罐式生物反应器气升式生物反应器透析袋或膜式生物反应器中空纤维生物反应器固定床或流化床

42、式生物反应器第九十一张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月二、动物细胞生物反应器的检测控制系统培养过程中需检测的物化参数：有些需要在线检测，如温度、pH、搅拌速度、溶氧等；有些则需要取样离线检测，如活细胞数、氨基酸浓度分析、葡萄糖乳酸和铵离子的检测等，有些则需在检测后计算后才能获得，如细胞的群体倍增时间、细胞的比增长率、葡萄糖消耗率、乳酸产率、生物反应器生产率等。第九十二张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月 动物细胞对搅拌引起的剪切力和气泡很敏感，要保持所需的溶氧很困难，常采用的措施有：改变进气的组成：不同比例的O2、N2、CO2和空气加大通气流量适当提高转速在反应器外通气加

43、入血红蛋白适当提高罐压第九十三张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月一、动物细胞产品常用的纯化方法二、动物细胞产品的质量要求第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求第九十四张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月下游纯化工作费钱、难度大成分复杂：工程细胞表达的产品，常常和细胞内容物、培养基成分，特别当采用有血清培养基时小牛血清中的各种蛋白成分都将与产物混杂在一起，这些成分的物化性质常常和目的产物非常相似，因此很难将他们分离开作用于人体的药物纯度要求高：由于产品多数用于人体，为防杂质对人体的有害作用，对产品的纯度要求很高第九十五张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月大多数动

44、物细胞表达的产物产量低，生物活性不稳定，因此要求纯化过程中所有的操作都应该非常温和、精细，包括溶液的温度、pH和盐离子强度等都需要严格控制，要有相当精密的设备和检测仪器。由于细胞产品多种多样，它们的氨基酸组成、结构、相对分子质量大小和等电点等都不尽相同，因此分离纯化技术的通用性差，必须根据每一种产品的特点研究开发出适合于该产品的专用的分离纯化技术。第九十六张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月一、动物细胞产品常用的纯化方法离心（低温离心）离子交换层析凝胶层析亲和层析盐析和有机溶剂沉淀透析高压液相层析第九十七张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月盐析和有机溶剂沉淀盐析：溶液中加入

45、无机盐类，破坏蛋白质分子周围的水化膜，使蛋白质溶解度降低而析出。最常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。调节盐浓度和pH常同时使用。盐析时蛋白不易变性，结束后需要进行透析、超滤脱盐。有机溶剂沉淀：加入与水可混溶的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，也可使蛋白质沉淀。为了避免蛋白质变性必须在低温下操作。第九十八张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月透析原理：蛋白质分子较大，不能通过半透膜，可以据此将蛋白质与相对分子质量较小的杂质分开。第九十九张，PPT共一百一十二页，创作于2022年6月高压液相层析（HPLC，high-pressure liquid chromatography） 使用颗粒极细的介质，在高压下分离蛋白质或其他分子混合物的层析