DB12-T841-2018转基因植物及其产品成分定量检测技术规范微流滴数字PCR法

1、ICS 65. 020. 20B 04DB12天 津 市 地 方 标 准DB12/T 8412018转基因植物及其产品成分定量检测技术规范微流滴数字PCR法Technical guidelines for quantitative detection of genetically modified plants andderived productsDroplet digital PCR method2018-12-01 实施2018- 11 -07 发布天津市市场和质量监督管理委员会 发布DB12/T 8412018 I本标准按照GB/T 1. 12009给岀的规则起草。本标准由天津市农村工

2、作委员会提岀并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所、天津 市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：兰青阔、兰璞、李亮、赵新、沈晓玲、王成、宛煜嵩、陈锐、黄凤军、李文、 李益歌。DB12/T 8412018 转基因植物及其产品成分定量检测技术规范微流滴数字PCR法1范围本标准规定了转基因植物及其产品微流滴数字PCR检测方法的建立与确认的总体要求。本标准适用于转基因植物及其产品成分检测的微流滴数字PCR检测方法的建立与确认。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1微流滴数字PCR droplet digital PCR将DNA模板、引

3、物/荧光探针、耐热DNA聚合酶及其缓冲液等PCR反应体系充分混匀后，通过乳化的方 式分配至体积相同且相互物理隔离的油包水微流滴中。将形成的微流滴进行PCR扩增，对扩增后的微流 滴进行荧光信号采集，通过阳性率和泊松分布计算获得样品中靶序列拷贝数或拷贝数浓度。2. 2靶序列 target sequence在PCR检测方法中，用作检测靶标的特异性DNA序列。2. 3特异性 spec i f i c i ty实时荧光定量PCR的引物和探针对样品中靶标片段精准识别的能力。2. 4定量限 I imit of quant i f i cat i on (LOQ)在可接受的正确度和精密度水平上，样品中被定量检

4、岀的最低DNA模板含量或浓度。2. 5正确度 trueness多次测试的均值与采纳的标准值之间的接近程度。2. 6方法确认 va I i dat i on of method通过提供明确的实验证据，证明所使用的检测方法能够充分满足测试目标的需求。3实验室资质进行转基因植物数字PCR检测方法制定的实验室，应满足以下要求：具备资质的转基因生物安全机构，从事过转基因植物成分定量测量工作，参加过权威部门组织 的转基因植物定量测量能力验证或计量比对，并且测量结果在可控范围内；具备承担转基因生物安全检测工作所需的仪器设备和环境设施；转基因植物数字PCR检测方法研制人员应具备转基因生物安全检测工作相关业务知

5、识。4技术要求4. 1 方法的建立4. 1. 1检测引物和探针的设计与筛选依据靶序列设计引物和探针，通过实验对其进行比较分析，筛选岀适合的引物和探针组合，确保其 对靶序列具有严格的特异性和符合要求的检测灵敏度。4. 1.2 PCR反应体系和反应程序优化通过试验确定适合的反应体系（模板量、引物、探针浓度等）及反应程序（退火温度、循环数等）， 能有效区分微反应体系的阳性信号和阴性信号。采用多重PCR检测方法的，应提供与单重PCR检测方法的 对比结果。4.1.3方法特异性测试通过试验验证检测方法的特异性；特异性测试样品至少应包括三类：含有靶序列的转基因植物材料；不含有靶序列的转基因植物材料；不含靶序

6、列的非转基因植物材料。4. 1.4方法灵敏度测试依据技术平台，选择合理的靶序列拷贝数浓度测试范围，确定方法的线性动态范围和定量限。灵敏 度测试浓度点数不少于5个，至少3次重复，每次试验至少设置3个平行。4. 1.5方法适用性测试选择合适的加工品类型，测试方法的适用性。4.2实验室内方法验证4. 2. 1线性度微流滴数字PCR方法的线性度以线性回归曲线的决定系数R2表示，均值应N0. 984.2.2精密度线性动态范围内的精密度用重复性相对标准偏差RSDr表示，应W25%。4.2.3正确度在整个线性动态范围内，多次测试的均值与采纳的标准值之间的接近程度，且偏差不超过标准值的 25%4. 2. 4定

7、量限线性动态范围内，符合精密度条件的最低拷贝数浓度。4. 2. 5再现性3DB12/T 8412018由两个不同操作人员，在两个不同时间段，对包含不同质量分数的同批样品（至少包括阳性样品、 阴性样品和定量限样品）进行测试。测试结果与预期偏差RSD应25%,表明方法再现性符合要求。否 则，重新进行相关测试。4.3实验室间方法确认4.3. 1经实验室内方法确认符合要求后，组织多家实验室对检测方法的特异性、灵敏度和再现性进行 实验室间确认。4.3.2实验室间方法确认样品应包括阳性对照样品、阴性对照样品、特异性测试样品和灵敏度测试样 品。4. 3. 3特异性测试样品应包括：含有靶序列的转基因植物材料；不含有靶序列的转基因植物材料；不含靶序列的非转基因植物材料。4.3.4灵敏度测试样品应包括定量限样品。4.3.5至少重复3次试验，每次试验至少设置3个平行。4.3.6实验室间方法确认不少于6个实验室提供有效数据。且至少重复3次试验，每次试验至少设置 3个平行。4.3.7线性度、精密度、正确度按照5. 2要求。4.3.8依据验证单位岀具的验证报告，从以下方面对建立的方法进行综合分析：特异性分析：阳性对照样