现代生物学实验介绍课件四蛋白技术

1、蛋白技术 在绝大多数生物现象（生物作用、生物反应、生物效应等）中，直接起作用的是蛋白质，是蛋白质种类、数量以及功能的变化所致。研究相应条件下，生物体内哪些蛋白质发生了种类、数量、功能上的变化，有助于这些生物现象机理研究和了解，以及获取生物标记分子。为什么要进行蛋白研究蛋白表达与纯化( protein expression and purification)蛋白质免疫印迹(Western blot)酶联免疫吸附分析(ELISA)质谱技术(Mass Spectrometry)常用蛋白技术蛋白表达与纯化 protein expression and purification蛋白表达是指用模式生物如细

2、菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。蛋白纯化主要是利用不同蛋白质之间的相似性与差异，依据蛋白之间的相似性可以去除非蛋白物质，再根据蛋白质的差异性将目的蛋白分离出来。蛋白表达与纯化的定义蛋白表达系统蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成： 1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。 2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载

3、体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。 3、辅助成分。帮助重组蛋白表达、修饰、提高稳定性和溶解性的辅助片段等。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。1.原核表达系统2.酵母表达系统3.昆虫表达系统4.哺乳表达系统蛋白表达系统原核表达系统常用原核表达系统为重组大肠杆菌（E.coli）在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快、产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。 目前已知的大肠杆菌的表达载

4、体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。 原核表达系统的优缺点原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。 代表：大肠杆菌表达系统。优点：遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单 缺点：蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白

5、糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。酵母表达系统酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用，应用此系统可高水平表达蛋白，且具有翻译后修饰功能，故被认可为一种表达大规模蛋白的有力工具。常用的酵母表达系统： 一 酿酒酵母表达系统 二 甲醇营养型酵母表达系统 酵母表达系统的优缺点代表：甲醇毕赤酵母 优点：表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵 缺点：部分蛋白产物易降解，表达量不可控昆虫表达系统昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修

6、饰加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。常用的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和家蚕型多角体病毒，常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用于表达外源基因的质粒来源于PUC系列，其含有一个多克隆位点和多角体蛋白启动子。 昆虫表达系统的优缺点优点蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配 蛋白翻译后的加工修饰 表达水平高，可达总蛋白量的50% 可容纳大分子的插入片段能同时表达多个基因。缺点外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控

7、之下，这时由于病毒感染，细胞开始死亡哺乳表达系统 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。 哺乳表达系统的优缺点优点：蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性 。缺点：表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高 。Expression System CharacteristicsCh

8、aracteristicsE. coliYeastInsectMammaliandoubling timerapid (30 min)rapid (90 min)slow (18-24 hrs)slow (24 hrs)cost of growth mediumlowlowhighhighexpression levelhighlow high low high low moderate protein foldingrefolding may be requiredrefolding may be requiredproper foldingproper foldingN-linked gl

9、ycos.nohigh mannosesimple, no sialic acidcomplexO-linked glycos.noyesyesyesphosphorylationnoyesyesyesacetylationno yesyesyesacylationnoyesyesyesg-carboxylationnononoyesproject costlowlowmiddlehigh蛋白表达流程目的基因设计引物载体表达宿主连接转化诱导表达蛋白纯化鉴定保存原核表达策略选择 明确实验目的选择表达载体选择表达菌株优化表达条件实验目的表达策略活性分析可溶表达制备抗原包涵体高纯度融合标签结构研究天

10、然蛋白明确实验目的系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEXGEtacAmpGSTTag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GSTTagpMalNEBtacAmpMBPTag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBPTagpETMerckT7T7lacAmpKanHisTag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。常用表达载体考虑因素细胞特性蛋白稳定性蛋白酶缺陷型B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶多种常用表达菌株均为此类，如BL21、Origami、Rosetta等启动子tac启动子

11、需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：BL21T7启动子需要能够提供T7 RNA聚合酶的细胞：DE3溶源菌抗性细胞不能与载体带有相同的抗性：pET-28a + OrigamiB(DE3)No！pET-21b + OrigamiB(DE3)Yes！严谨调控BL21(DE3)pLysS / BL21(DE3)pLysE稀有密码子Rosetta系列溶解性Origami系列稀有密码子不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。选择表达菌株常用表达菌株菌株适合启动子特性BL21tac、trc(pGEX、pMa

12、l)适用于非T7启动子的表达系统BL21(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)适用于T7、T7lac的表达系统，适用于非毒基因的表达BL21(DE3)pLysST7/T7lac(pET，pEASY)质粒pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，可结合T7 RNA聚合酶，降低本底表达水平。适用于严谨调控毒基因的表达Rosetta(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平OrigamiB(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)具有thioredoxin reductase/glutathione

13、reductase双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。毒基因：基因表达产物即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”）优化表达条件葡萄糖：抑制cAMP形成，进而抑制表达，严谨调控无其他严谨调控手段（pLysS）且毒基因时，至关重要！温度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性IPTG浓度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性lac透性酶(lacY1)突变使IPTG均一渗透，获得浓度依赖的诱导：Tuner，OrigamiB，Rosetta其他因素：菌体密度Mg2+培养体积与通气纯化策略选择常用实验流程蛋白纯化根据蛋白自身特点选择纯化方案可溶/包涵体 融合标签表面净电荷分子量其它特点蛋白纯化策略选择可溶/

14、包涵体可溶蛋白无需变性步骤适用于亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法包涵体需要洗涤、变性、复性（如有需要）等步骤适用于某些亲和层析方法（6HisTag）、离子交换层析不适用于某些亲和层析方法（GSTTag、 MBPTag ）不适用于凝胶过滤层析等方法蛋白特性融合标签6HisTagGSTTagMBPTag标签大小6 aa26 kDa42 kDa原理金属螯合层析酶-底物特异结合酶-底物特异结合溶解性可溶/包涵体有助可溶表达有助可溶表达纯化条件天然/变性条件下纯化仅天然条件下纯化仅天然条件下纯化洗脱条件咪唑，低pH还原型谷胱甘肽麦芽糖是否去除通常不需要依实验目的而定依实验目的而定蛋白特性表面净

15、电荷与蛋白质等电点、溶液pH值密切相关离子交换层析的重要标准分子量天然构象下，蛋白分子正确折叠，近似球形，大小与分子量成正比凝胶过滤层析的重要标准其他特点利用蛋白质本身的特点进行亲和层析耐热蛋白可用热变性法进行纯化蛋白特性常用实验流程菌体裂解蛋白抽提蛋白粗制品层析纯化分离提纯蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使

16、细胞胀破。4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等菌体裂解 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。蛋白质的抽提 如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、Triton X-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同

17、蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。蛋白质粗制品层析纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析离子交换纤维素层析亲和层析等等亲和层析原理 亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定

18、在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。蛋白质免疫印迹Western blot 蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治斯塔克（George Stark）。在尼尔伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的分析生物化学（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。 蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某

19、特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。Western Blot 介绍寻找目的蛋白是否存在样品中蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。Western Blot 应用Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原（即细胞中的目的蛋白）能特异性结合的原理，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂（如酶、金属离子、同位素）显示一定的颜色或发光来对组织细胞内目的蛋白定性及半定量的研究。抗原一抗生物素标记的二抗ECL发光试剂Western Blot 实验原理聚丙烯酰胺凝胶为网

20、状结构，具有分子筛效应。它有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS);非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基硫酸钠)后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。SDS电泳的基本原理SDS电泳的基本原理阴离子去污剂SDSSDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助

21、溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。蛋白质分子变性的蛋白质分子在电场作用下，SDS-蛋白质从负极向正极移动，小分子蛋白质的迁移速率快于大分子蛋白质。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用515%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：丙烯酰胺浓度（

22、%）线性分离范围（kD）1512431016687.536945.057212SDS凝胶分离范围Western Blot流程制胶上样电泳推荐电泳条件：浓缩胶 80V 3545min分离胶 120V 4575min转膜 半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 |纸|胶|膜|纸|槽式湿转法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。 |海绵|纸|胶|膜|纸|海绵|封闭将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白质的区域结合上蛋白质，目的是使抗体与特异的蛋白质结合。 封闭液 5 % TBST脱脂奶粉溶液（30ml） 牛血清白蛋白溶液( BSA ) 摇床上缓慢摇动

23、封闭，室温2 h或4过夜。Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。免疫反应 1. 按照抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释抗体；2. 抗体孵育时间：室温下孵育12h或4过夜（一般不超过18小时）；3. 保持适当的摇动使抗体与膜的结合均匀；不同二抗稀释浓度的效果图显色DAB显色法 ECL显色法ECL显色 比较常用，但是灵敏度差一点DAB显色 比较灵敏，是HRP最敏感的底物电解质电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。酸碱度抗原抗体反应需要适宜的pH值环境，一般为pH6.0-8.0。温 度温度升高可使反应加速，但温度高于56时，可导致抗

24、原抗体的解离，甚至变性。影响抗原抗体反应的因素酶联免疫吸附实验(ELISA) ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种免疫测定（immunoassay，IA） 。 原理:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。ELISA的原理ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate

25、）；（3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。 双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。酶标抗体血清样品或参比品底物酶标仪测定OD值终止液特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物；加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，酶量与标本中受检物质的量成正相关；加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量间接法测抗体 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包

26、被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。酶标抗体 样本稀释液血清样品或参比品 底物终止液将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；加受检血清：其特异抗体与抗原结合， 形成固相抗原抗体复合物。加酶标抗抗体：与固相抗原抗体复合物中的 抗体结合，使该抗体问接地标记上酶；固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。 血清样品或参比品 酶标抗体 终止液 底物质谱技术Mass Spectrometry什么是质谱？ 质谱分析技术的基本原理质谱是带电原子、分子或分子碎片按质荷比的大小顺序排列的图谱。质谱分析

27、技术主要是通过对样品的离子的质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。质谱基本概念质谱发展概述1839 W.Wien 发现带正电荷的离子束在磁场中发生偏转。1910 J.J.Thompson 使用简单的电场-磁场组合装置，获得了抛物线族 的质谱，证明了Ne同位素的存在1918 A.J.Dempster 采用电子轰击技术使分子离子1919 F.W.Aston 制得了第一台速度聚焦质谱仪。并用于发现同位素、测定相 对原子质量，因而于1922年获得诺贝尔化学奖。1940 Nier A O 研制成功扇形磁场单聚焦质谱仪。50年代初： 质谱仪器开始商品化并广泛用于各类有机物的结构分析 。 同时质谱方法与NMR、IR等方法结合成为分子结构分析的 最有效的手段。80年代： 非挥发性或热不稳定分子的分析进一步促进了MS的发展。90年代： 由于生物分析的需要，一些新的离子化方法得到快速发展。质谱