分光光度计讲稿

1、关于分光光度计第一张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月光学分析法 光学分析法是一类极其重要和最常用的仪器分析方法。它是基于电磁辐射与物质相互作用后产生的物理现象(辐射，吸收或散射)而建立起来的分析方法。它既可以进行定性，也可以进行定量和结构分析，其应用范围非常广泛。第二张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月光学分析法光谱法非光谱法 非光谱法是基于光与物质相互作用时，通过测量电磁辐射的 诸如折射、干涉、散射、衍射及偏振等基本性质发生变化的分析方法。 非光谱法中，电磁辐射只改变了传播方向及速度等，而物质的内能不发生变化。属于这类分析方法有的折射法、浊度法、旋光法、散射等方法。 光谱法

2、是基于光和物质相互作用时，测量由物质内部发生量子化的能级间的跃迁所产生的发射，吸收或散射光谱的波长和强度进行分析的方法。1. 光学分析法分类第三张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月 原子光谱是原子外层或内层电子产生能级跃迁而形成的，其光谱为线状光谱。属于原子光谱分析的方法有原子发射光谱法(AES)、原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS) 及X射线荧光光谱法(XFS, X-Ray Fluorescence Spectrometry )等。 光谱法原子光谱分子光谱 分子光谱则是分子中电子能级、振动和转动能级的变化形成的，其光谱为带状光谱，也即连续光谱。属于该类分析方法的有紫外-

3、可见分光光度法(UV-vis)，红外吸收光谱法(IR)，分子荧光光谱法(MFS)及化学发光法(CLS)和分子磷光光谱法(MPS)等。2. 光谱法分类第四张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月应用领域：物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学、化工、医药、环境检测、冶金。分光光度法是建立在分子对于光吸收基础上的一种分析方法，它属于分子光谱的范畴。可用于无机物和有机物的定量分析，也可以进行有机物的定性及结构分析。3. 分光光度法第五张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月 物质颜色和吸收光颜色的关系 吸 收 光 物质颜色 颜 色 波 长(nm) 黄 绿 紫 400 450 黄 蓝 4

4、50 480 橙 绿 蓝 480 490 红 蓝 绿 490 500 紫 红 绿 500 560 紫 黄 绿 560 580 蓝 黄 580 600 绿 蓝 绿 600 650 蓝 绿 红 650 750第六张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月UV/VIS/NIR 光照射到物质上 入射光I0透射光I1 光程长 自光源 透射率 T =I0I1检测器吸收光谱第七张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月朗伯定律（1760年）：物质对光的吸收与物质厚度成正比:A=f(b)比耳定律（1852年）：物质对光的吸收与物质浓度成正比:A=f(c) 紫外/可见分光光度计的简单原理：第八张，PPT共一

5、百零一页，创作于2022年6月LAMBERT-BEER定律此处T: 透射率e: 摩尔消光系数l: 光程长 C: 浓度 吸收 A = log = e C l1T 当一束平行的单色光通过某一均匀溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的长度的乘积成正比。成立条件：单色光 稀溶液第九张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月A = log = - log T = e C l = abc吸光度、透过率与浓度的关系（波长、吸收池光程一定）%T 浓度1T第十张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月分子吸收光谱 * 分子也具有特征的分子能级。分子内部的运动可分为: 价电子运动，分子中原子在平衡位置的振动

6、和分子绕其中心的转动。因此分子具有电子能级、振动能级和转动能级。 *当分子受到外界的光能照射之后，引起分子能级与原子能级跃迁不同。当分子受到外界的光能照射之后，引起了分子中价电子的能级跃迁, 同时，也引起分子中原子的振动能级和转动能级的跃迁即从基态能级能级跃迁到激发态能级。第十一张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月电子能级差E最大，一般为120eV，电子光谱在紫外-可见区；吸收光波长范围200 400 nm（近紫外区） ，可用于结构鉴定和定量分析。吸收光波长范围400750 nm (可见区)，主要用于有色物质的定量分析振动能级差E次之，一般为0.051eV；纯振动光谱在红外区；吸收光波

7、长范围2.51000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。转动能级差最小，一般为0.0510-4eV，纯转动光谱在远红外区。产生原因：吸收光谱产生是由于分子中价电子能级的跃迁和分子与离子中的振动及转动能级的跃迁引起的。光谱与电子的跃迁第十二张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月*分子吸收能量同样具有量子化的特征，即分子只能吸收等于两个能量之差的光子能量，产生三种能级跃迁。由于三种能级跃迁所需能量不同，所以需要不同波长的电磁辐射使他们跃迁，及在不同的光学区域产生吸收谱带，便产生了相应的三种光谱一电子光谱，振动光谱和转动光谱。 E电子E振动E转动 根据量子理论，分子吸收的能量应与能级差相对应，

8、也即被吸收的光子的频率应与分子跃迁的能级差相适应： E=E2E1=h或=(E2-E1)/h=E/h 式中E电子、E振动、E转动分别表示电子运动状态的能量、分子中原子间的相对振动及分子绕其质量中心转动的能量。第十三张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月*分子对紫外-可见光的吸收所产生的光谱是具有较宽波长范围的吸收带。在分子中每个电子在能级之间产生跃迁的同时伴随有许多振动和转动能吸的跃迁。所以，分子对紫外-可见光的吸所产生的光谱是具有较宽波长范围的吸收带，它是由许多波长非常接近的线状光谱聚集而成，称其为带状光谱。如图所示。K2CrO4吸收曲线/nmA200 250 300 350 400 4

9、50 5000.600.10.20.30.40.5能量E230 240 250 260 270 nm苯蒸气的吸收光谱第十四张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月可见分子的能量由多方面因素决定的，其总能量由下式表示： E总= E电子+E振动+E转动 在分子中，每一个电子能级都有多个可能的振动能级存在；而每一个振动能级又有许多可能的转动能级存在。所以，一个分子所具有的能级数目远远多于原子能级数目。因此，分子吸收光谱比原子光谱复杂得多。 紫外吸收光谱及可见吸收光谱，一般包含若干谱带系，不同谱带系相当于不同的电子能级跃迁，一个谱带系（即同一电子能级跃迁）含有若干谱带，不同谱带相当于不同的振动能级

10、跃迁，同一谱带内又包含若干光谱线，每一条相当于转动能级的跃迁。它们的间隔约为0.25nm。一般的分光光度计，由于分辨率的限制观察到的为合并成较宽的带，所以分子光谱是一种带状光谱。第十五张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月AB纯电子跃迁V，=02341纯振动跃迁纯转动跃迁V=01图9-3 双原子分子的能级跃迁示意图第十六张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月溶剂效应 一般紫外光谱的测定都是在稀溶液中进行。用特殊附件（积分球）可做固体样品。 溶剂应能溶解测定的化合物，并在测定的波长区透明。 根据测定的波长范围选溶剂，溶剂的透明范围的下限应小于测定波长范围。第十七张，PPT共一百零一页

11、，创作于2022年6月苯在非极性溶剂庚烷溶液中，有一系列中等强度的吸收峰并有精细结构；但在极性溶剂乙醇中，其精细结构完全吸收，呈现一宽峰。因此，在绘制紫外一可见吸收光谱时须注明所用何种溶剂。 230 240 250 260 270 Amax图9-7 苯在极性和非极性溶剂中的吸收光谱有些溶剂，尤其是极性溶剂的加入对溶质吸收光谱产生影响，引起吸收带形状、max及强度发生变化，这种现象称为溶剂效应.。 在紫外吸收光谱分析中常用水、乙醇、已烷、庚烷、环已烷、异辛烷等做溶剂。第十八张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月 表2-3 紫外光谱用溶剂 溶 剂 透 明 下限（nm） 溶 剂 透 明下限 (

12、nm) 95% 乙 醇 210 乙 醚 210 水 210 异 辛 烷 210 正 己 烷 210 环 己 烷 210 二 氯甲烷 235 二 氧 六 环 230 四 氢 呋 喃 220 氯 仿 245 四 氯 化 碳 265 苯 280 DMF 270 丙 酮 330 异 丙 醇 210 甲 醇 215 乙 腈 210 庚 烷 210第十九张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月分光计的应用 紫外-可见分光光度法不仅可以用来进行物质的定量测定，定性分析及结构分析，还可以测量一些诸如摩尔比、分子量、稳定常数、离解常数等物理化学参数。第二十张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月nmR%

13、反射谱光学常数通常不能直接测量，但反射谱或吸收谱可以通过光度计来测量，根据K-K关系可从测得的谱图计算求得任一光学常数1. 吸收反射透射光谱第二十一张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月Krames-Kronig 变换反射系数：r=rr +iri = r0eiqR(w)=f(w)R(w)=| r0 |2计算出所有的光学常数第二十二张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月2. 定量分析 广泛用于各种物料中微量、超微量和常量的无机和有机物质的测定。组分测定 对于简单样品单组分测定一般采用简单的经典方式。 标准对照法 标准曲线法 吸收系数比较法 标准加入法（可克服复杂样品的基体效应 分为单

14、加入和多加入两种) 最小二乘法（可消除用单一浓度标准溶液测定吸 收系数时实验条件影响所引起的偶 然误差。 差示分光光度法（可提高测定的高浓度或低浓 度的准确度)第二十三张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月1、标准曲线法 该方法是实际工作中常使用的方法。 具体做法是：配制一系列浓度不同的标准溶液，以空白试剂为参比，在相同测量条件下测定其吸光度，以吸光度A对浓度C作图并绘制工作曲线。在相同条件下测量未知试样的吸光度AX，在工作曲线上查找AX所对应的浓度即为未知液的浓度。根据测定的标准系列的数值建立线性回归方程，并求出相关系数P(或R2)。若P在0.999X以上时，认为所建立的方法是符合比尔

15、定律的。第二十四张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月2、标准加入法(1)单标准加入法 在两份相同量或体积的未知试样的一份中加入一标准溶液，在相同条件下测量其吸光度AX和AX+S，根据下式计算未知液浓度CX 。 AXKCxAX+SK(CX+CS)(2)多次加入法 在57份相同量或体积的未知试样溶液中加入46份浓度不同的标准溶液，组成一个新的标准系列，在相同测量条件下测定其吸光度值，以吸光度对Cs作图，绘制工作曲线。该工作曲线是一条不过原点的曲线，与浓度轴的交点即为CX。 *用标准加入法，既可消除复杂基体对测定结果准确度的影响，又可用回收率的高低，来验证某一分析方法的可靠性。第二十五张，P

16、PT共一百零一页，创作于2022年6月3、差示分光光度法 在分光光度测定方法中，样品的浓度过大过小，其吸光度值在0.20.8范围之外，都会给测量结果带来较大的误差。为了克服上述不足，在实际工作中改用与试样浓度差别不大的标准溶液代替空白溶液作参比，调节仪器的100%透光率或0%透光率，测量待测物质的方法即为差示分光光度法。它分为三类：(1)高浓度差示法 这种方法是用一个比待测组分浓度稍低一点的标准溶液(CS)为参比，调节仪器透光率为100%，然后测量未知样品溶液的吸光度。假定用普通法测量用作参比的标准溶液的透光率为10%，试液的透光度为7%，二者读数差仅为3%。当用差示法测量时，将参比液的透光率

17、读数调到100%，此时，试液的透光率将会增加到70%，二者相差30%，相当于读数标尺放大了10倍。第二十六张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 T%试样溶液 参比溶液 图9-21 高浓度差示法标尺扩展示意图第二十七张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月在差示法所测得的吸光度为ArAx-As，而 Aslcs Axlcx Arl(cxcs)lC (9-13) 上式中Cs为一固定值，所以Ar与Cx或C或线性关系，工作曲线为一过原点(原点不为0，为Cs)的直线

18、，且处在正常的读数范围之内(见图9-21)。以Ar-Cx(或C)作图，在工作曲线上根据Ar就可查出相应的Cx(或C)，CxCs+C。根据吸收定律推导出其相对误差为 ,式中CXCS+C，CS是一个确定的较大值，C或CX很小，所以，测定结果非常准确，误差很小。第二十八张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月(2) 低浓度差示法 这种方法是用一个较待测组分浓度稍高一点的标准溶液(CS)作参比，调节仪器透光率为0%，而用空白溶液调节透光率为100%，测定待测试液(CX)的透光率或吸光度的方法即为低浓度差示法。其原理示意图见 图9-22。0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10

19、0 Tx-Td0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100T%试样溶液TdTx参比溶液 图9-22 低浓度差示法第二十九张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月例如 某一标准溶液(Cd)透光率Td为90%，待测液透光率TX为95%，二者透光率差5%。用前者代替光闸，调节仪器暗电流补偿到透光率T为0%，用空白溶液作参比调T为100%，这时待测试样溶液透光率(Tr)扩大到50%，二者透光率相差50%，也相当于读数标尺扩大了10倍。由图9-17推导出：（9-14)而待测组分的吸光度： AxlogTxlcg(Tr-TdTr+Td) -lcg(10-Ar-Td10-Ar+Td)l

20、cx (9-15) 可以看出，低浓度差示法的差示吸光度Ar与试样浓度(Cx)不成线性关系，工作曲线为一过原点的曲线。第三十张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月(3)最佳精密度法 此法是上述两种方法的结合，是用两个标准溶液作参比，用一个较待测试液稍浓的参比液(Cd)调节仪器透光率为0%，再用一个较待测试液稍稀的参比液(Cs)调节透光率为100%，然后测定未知液(Cx)的吸光度。其原理如下页图。第三十一张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月图9-23 最佳精密度差示法工作原理示意图0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60

21、 70 80 90 100 T%参比溶液 试样溶液参比溶液 Tx-TdTrTdTsTxTs -Td第三十二张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月由图(9-18)式可推导出差示法的透光率Tr如下：则(9-17) 由(9-17)式可知最佳精密度差示法的差示吸光度Ar与Cx不呈线性关系，工作曲线为弯曲的线。第三十三张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月(二)、多组分混合物的测定 如果混合物中含有两种或两种以上吸光物质时，吸收峰相互干扰各异。 简单的情况是双组分在各自最大吸收波长处相互不重迭，此时，可在各自最大吸收波长处测定吸光度。 在实际测定工作中，共存组分往往会干扰待测成分的测定。干扰

22、情况如图9-24所示。第三十四张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月 840 880 920 960 波长，nm 0.6 0.10.20.30.40.5ANdCl3DyCl3866nm915nm(1)NdCl3和DyCl3的吸收曲线；图9-19 （1）第三十五张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月3. 定性分析每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困难。 定性分析主要是用于有机物定性鉴别和结构分析。 利用紫外吸收光谱鉴定有机化合物主要依据是化合物的吸收光谱特征: 吸收曲线的形状 吸收峰数目 吸收峰波长

23、 摩尔吸光系数第三十六张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月 *紫外光谱对于差别有机化合物中发色基团和助色基团的种类、位置及其数目以及区别饱和与不饱和化合物、测定分子中共轭程度等有其独特的优点 *有机化合物的紫外吸收光谱只有少数几个宽的吸收带，缺乏精细结构。它只能反映分子中发色基团和助色基团及其附近的结构特性，而不能反映整个分子的特性。因此仅依靠紫外光谱来推断未知化合物的结构是困难的。 *紫外光谱可用来测定共轭分子及芳族化合物分子的骨架，并可研究与共轭作用、溶剂稳定化作用有关的分子构型以及互变异构现象和氢键等。 第三十七张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月1. 用紫外光谱进行定性

24、鉴定的化合物必须是纯净的，并按正确操作方法用紫外分光光度计绘制出吸收曲线，然后根据该化合物的吸收特征作出初步判断。 如果化合物紫外光谱在220400nm范围内没有吸收带，则可以判断该化合物可能是饱和的直链烃、脂环烃或其它饱和的脂肪族化合物或只含一个双键的烯烃等。 若化合物只在270350nm有弱的吸收带，则该化合物必含有n电子的简单非共轭发色基团，如羰基、硝基等。第三十八张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月 若化合物在210250nm范围有强吸收带，104Lmol-1cm-1,这是K吸收带的特征，则该化合物可能是含有共轭双键的化合物。如果强吸收带出现在260300nm范围内，则表明该化

25、合物存在3个或3个以上共轭双键。如吸收带进入可见光区，则该化合物是长共轭发色基团的化合物或是稠环化合物。 若化合物在250300nm范围内有中等强度吸收带，103 104Lmol-1cm-1 ，这是苯环B吸收带的特征，因此该化合物很可能含有苯环。第三十九张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月2. 按上述规律可以初步确定该化合物的归属范围后，再将该化合物光谱与标准化合物的谱图进行对照。 如果两者吸收光谱的特征完全相同，则可考虑两者可能是同一化合物，或者它们具有相同的分子骨架和发色基团。也可以与一已知的模型化合物的紫外光谱相对比后作出判断。第四十张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月1

26、、吸收曲线比较法 将未知物和所推测化合物的标准品在相同的酸度条件下，以相同的浓度配制在相同溶剂中，分别扫描吸收光谱。比较二者的吸收曲线，若二者一致，则可确定二者为同一化合物。如果没有标准品时，也可和标准品的标准图谱进行比较。 在实际测定中，也常用紫外吸收峰的最大吸收波长max和强度(即max)进行定性鉴定。通常用于定性分析的方法有以下几种：第四十一张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月图9-24 合成与天然VB2的紫外吸收光谱实线为合成VB2，虚线为天然VB2Log 342 300 350 400/nm第四十二张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月例如，烟碱(居古丁)在0.2mol

27、L-1H2SO4中max260nm，百分吸光系数 343。若某一化合物在相同条件下测定其max和 与纯烟碱的数据相同，则该化合物结构与烟碱的结构基本相同。常用的标准图谱有下列几种：1、Sadtler Standard Spectra(Ultraviolet),Heyden,London,1978 该标准图谱总计收集了46000种化合物的紫外吸收光谱。2、Friedel R.A.and Orchin M.,：“Ultraviolet Spectra of Aromatic Compounds”,Wiley,New York,1951.3、Keyzo Hirayama:“Handbook of U

28、ltraviolet and Visible Absorption Spectra of Organic compounds”,New York,Plenum,19674、“Organic Electronic Spectral Data”,1946- 这是一套由众多学者集多年之经验而共同编写的大部头手册 性丛书，始于1946年，延续至今不断续编。第四十三张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月 有时仅用紫外吸收光谱来确定一个未知化合的结构难以下结论时，还需要采用经验规则计算一些不饱和有机化合物的最大吸收波长max，并与实验测得值加以比较，再确切认证化合物的结构。一般常采用的经验规则：1)

29、伍德沃德(Woodward)经验规则 这是计算共轭二烯、多烯烃和共轭烯酮类*跃迁最大吸收波长max的经验规则，如下表所示。计算过程中，先以母体生色团得到一个最大的吸收的基数，然后再加上连接在母体电子体系上的不同取代基(助生团）以及其它结构因素的修正值，即为计算值。2、经验规则计算法第四十四张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月4. 纯度的检查如果某一化合物的紫外-可见光谱区无明显的吸收峰，而它的杂质有较强的吸收峰，可利用这些非正常吸收峰检查杂质的存在。 例如酒精在2001000nm范围内无吸收峰，若在256nm处有一吸收峰且有振动带，则证明酒精中可能含有杂质苯。 又如检查CCl4中有无C

30、S2杂质，只要在318nm附近观察有没有明显的吸收即可确定之。第四十五张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月另外，若某一有机化合物在可见区或近紫外区有较强的吸收峰，也可以利用吸收系数的大小来检查其纯度。例如: 菲的氯仿溶液在296nm处有一强吸收(log4.10)。用某一既定方法精制菲，测得其熔点为100，沸点为340，似乎很纯净，但用分光光度法检查时，测得的log值为3.77，低于纯菲log(4.10)，实际含量只有92%(即(3.77/4.10)100)，其余可能是蒽等杂质。第四十六张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月5. 可疑化合物的证实6. 结构分析（如鉴定官能团）第四十

31、七张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月按通过试样及参比溶液的光束多少可分为： 单光束分光光度计 双光束分光光度计按所提供的波长数分为： 单波长分光光度计 双波长分光光度计分光光度计第四十八张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月第四十九张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月原理示意图时间式第五十张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月光源 单色器 样品 检测器 读数装置分光光度计的组成光电倍增管光电池 分光光度计结构示意图光源提供的连续辐射，经单色器色散后获得有限波长范围的辐射，待测物质吸收后到达检测器，将光信号转换成电信号(电压或电流，在读数装置上显示出测量值)。先进的

32、仪器配有记录仪或微处理机进行控制和测量第五十一张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月光源 在光度分析中所用的光源在所需的光谱范围内能连续辐射出足够稳定和强度的辐射线，其辐射强度随波长的变化波动不大，而且使用寿命要长。 分光光度分析中所用光源有: 热光源(钨灯、卤钨灯)、 气体放电灯(氢弧灯、氘灯、氙灯、汞灯)、 激光光源 钨灯适用波长范围为 氢弧灯适用波长范围为 3202500nm。 165350nm。第五十二张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任 波长单色光的光学系统。 入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准光装置：透镜或返射

33、镜使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝。单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。第五十三张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月 样品室 样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。玻璃吸收池-能吸收UV光，仅适用于可见光区石英吸收池-不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区 一般石英比色器光

34、程为1cm，玻璃比色器光程有1cm、2cm、3cm等。第五十四张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月双单色器的高灵敏度紫外可见分光光度计 UV-3150型（Shimadzu）配备高效率的双单色器，高能量的装置适合从液体样品到硅、薄膜、玻璃、光学材料等的透射、反射测定。测定波长范围： 1903200nm谱带宽度： 0.130nm分辨率： 最小0.1nm杂散光： 0.00008%以下（220nm,Nal）分光器： 由2组3枚光栅构成的上单色器第五十五张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月UV-3150紫外可见近红外分光光度计 第五十六张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月5 度入

35、射角反射附件镜反射：入射角等于出射角，法线为对称轴物体表面平整光滑第五十七张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月仪器光源：由氘灯和溴钨灯组成，换灯波长可在340-360nm之间选择检测器：光电倍增光 和 PbS 光电池（近红外区）样品池： 石英比色皿 第五十八张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月石英比色皿的正确清洁方法附着有色物质时用1mol/L HCl-乙醇溶液(1:2)清洗，再用蒸馏水洗净。附着油污时用5NaOH溶液清洗，再用蒸馏水洗净。日常使用时直接使用清水洗净，然后用纯水再洗一次，置通风机吹干或者自然晾干即可。若太脏可用洗液清洗，但时间要短（几秒钟)，并立即用大量清水清洗

36、干净。但不要用洗洁精之类的清洁剂，以免影响测量。注意事项一般石英比色皿为粘接的，尽量不要使用超声波清洗，使用时间不要超过5分钟，功率不要太大，要用清洗玻璃器皿的超声波清洗机且清洗时毛面需朝下。使用超声清洗很可能导致比色皿出现裂缝。 第五十九张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月积分球积分球，又称光通球，是一个中空的完整球壳。内壁涂白色漫反射层，且球内壁各点漫射均匀。光源在球壁上任意一点上产生的光照度是由多次反射光产生的光照度叠加而成的。主要功能是光收集器，能收集样品上的全部反射光，被收集的光可以用作漫反射光源或被测源。Intergrating Sphere inner Diameter

37、150mm fMearuring Wavelength Range 240-2400nm(UV-VIs-NIR)第六十张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月原理 一束光聚射到积分球内壁时，经过多次反射，内壁各点的照度相同。 Em=积分球壁按一定的规律开一样品孔，依次放两个样品（其中一个做标准样，已知其反射率），用同样强度的一束光照射到样品上，经过多次反射，球壁各点的照度相同，任一点的照度与样品的反射率成正比，在某一点放放置一个光能感受元件，其输出与球壁上的照度成正比，两次输出值之比就等于两个样品的反射率之比。第六十一张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月积分球原理第六十二张，PPT

38、共一百零一页，创作于2022年6月0度与8度的区别测试范围：紫外-可见 紫外-可见-近红外第六十三张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月影响紫外仪器质量的几个重要指标一、光度准确度与重复性定义：多次测量平均值与真值之差为光度准确度（T 、 A）；最大值与最小值之差为光度重复性。偏差越小，准确度越高。光度准确度和光度重复性是非常重要的技术指标，直接关系到测试结果的准确性。 光度准确度在不同的吸光度范围是不同的，因此光度准确度的表示一定要指出在多少吸光度或在多少透射比情况下测试的。影响光度准确度的主要因素有： 仪器的杂散光大小。 仪器的光谱带宽 仪器的光度噪声 试样的制备 仪器的基线平直度

39、比色皿的性能 第六十四张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月光度准确度的检查: 一般用标准滤色片或的重铬酸钾的0.005mol/L H2SO4溶液。酸性重铬酸钾溶液的标准吸收值如下： 吸 光 度 测量波长(nm) 溶液A (50mg/L K2Cr2O7) 溶液B (100mg/L K2Cr2O7) 235（谷） 0.626 0.09 1.251 0.019 257（峰） 0.727 0.007 1.454 0.015 313（谷） 0.244 0.004 0.488 0.007 350（峰） 0.536 0.005 1.071 0.011第六十五张，PPT共一百零一页，创作于2022年6

40、月光度准确度与吸光度相对误差和吸光度真值的关系第六十六张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月二、杂散光定义：单色器额定通带以外的透射辐射能量与总的透射能量之比，也就是光谱通带以外“不要的”光通量就是杂散光。 杂散光是一个非常重要的关键技术指标，它是紫外/可见分光光度计分析误差的主要来源，直接限制被分析测试样品的上限。当仪器的杂散光一定时，被分析样品的浓度越大，其分析误差就越大。 杂散光的主要来源： 1、灰尘沾污光学元件。 2、光学元件被损伤。 3、准直系统内部或有关隔板边缘的反射。 4、光学系统屏蔽不好。 5、热辐射或荧光引起的二次电子反射。 6、狭逢的缺陷。 7、光学系统的像差。、 8

41、、单色器内壁黑化处理不当。 光栅是杂散光的主要来源，占总杂散光的80%。测定方法：一般采用标准滤光片或10g/L的NaI及NaNO3水溶液。在紫外区测定220nm(NaI)或340nm(NaNO3)处的透过率%T ，在可见光区用384mg/L的KMnO4 ，测定525nm处的透过率%T 。第六十七张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月 杂散光与吸光度相对误差和吸光度真值的关系第六十八张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月举例： 比如对某生物酶检测：假设测定的吸光度为1.95Abs,要求达到1%误差；仪器的杂散光为0.2%，行不行？ 不行！为什么？因其误差为3.6%！只有当仪器的杂散

42、光为0.05%,才可达1%! 见前图。第六十九张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月 不同程度杂散光对比尔定律的偏离0.1%T第七十张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月三、噪声定义： 无样品时仪器自身的波动。 也就是说：噪声是叠加在待测量的分析信号中不需要的信号，即零信号上下波动的振幅宽度。重要性： 光度噪声影响光度测量的灵敏度（信噪比）、精密度和准确度。限制测定浓度的下限，是分析误差的主要来源。主要来源： 光学系统、光源、检测器、电子元器件及电路设计等。 噪声的测定： 在时间扫描方式下，于500nm波长处连续测量120秒钟，由所记录的吸光度时间光谱图量出峰峰值即为仪器的噪声。改

43、变仪器的响应时间可改善信噪比。 第七十一张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月 噪声与吸光度相对误差和吸光度真值的关系第七十二张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月四、稳定性定义： 是指不放置样品情况下，零吸收读数在一定时间内偏离的程度（1小时内仪器自身的漂移量）。影响稳定性的主要因素： 光源（氘灯：电源1%-光6.7%；钨灯：电源1%-光3.4% ） 光电倍增管(电源1%-放大后的信号12% ) 温度、环境等重要性： 同样是分析误差的主要来源。影响测定的重现性与准确度，严重甚至根本无法测定。测定方法： 在时间扫描方式下，仪器预热2h，于500nm波长处连续测量1小时，由所记录的吸

44、光度时间光谱图曲线的峰峰值检查仪器的稳定性。第七十三张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月五、基线平直度定义： 基线平直度是指不放置样品情况下，全波段扫描（需先进行全波段范围基线校正），基线倾斜或弯曲的程度以及各个波长点的光度噪声（P-P）。原因： 光学系统失调； 参比光束与样品光束不平衡； 仪器受震、光源位置改变。重要性： 它是各个波长上主要分析误差的来源之一，平直度不好使样品吸收光谱中各吸收峰之间的比值发生变化，给定性分析造成困难。第七十四张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月六、波长准确度与重复性 波长准确度：多次测量平均值与真值之差。 波长重复性：多次测量值中最大最小值之差

45、。 波长重复性在扫描速度、分光带宽、吸光度一 致情况下主要体现为仪器机械重复性。 测定方法：用汞灯（546.07nm、253.65nm)、 氘灯(656.1nm、486.0nm) 或者用标准滤色片。 重复单向扫描三次，计算最大差值。 重要性：吸光度是随波长而变化的，波长准确度、重复性不 合格，何谈分析第七十五张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月七、 光谱带宽(SBW)定义：谱线的半宽度。 SBW不等于狭缝宽度，关系如下： SBW=d（/mm)b（mm) b狭缝宽度，以mm计。d(/mm)倒线色散率。SBW的重要性：影响光度准确度和分辨率。 如何影响分析测试结果？见下图：第七十六张，PP

46、T共一百零一页，创作于2022年6月 光谱带宽与光度准确度的关系第七十七张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月UV Probe软件包第七十八张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月装置的连接 第七十九张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月初始化大约需要5分钟左右，进行一系列的检查和初置 第八十张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月标准工具栏第八十一张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月光谱模块主要作用是控制分光光度计在一定的波长范围内扫描，记录吸收值、透射率、反射率或能量在各波长的读数。动力学模块基本功能是控制分光光度计，观察在固定波长下吸收值、透射率、反射率或能量

47、随时间的变化。光度测定模块基本目是测定样品中某些物质的浓度。通过手动输入或分光光度计采集读数的方法建立 标准 和样品数据表。建立和查看标准曲线和样品图。使用标准曲线或K-因子方程计算未知样品的浓度值。报告生成器所见即所得地编辑报告第八十二张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月基线，调零光谱模块第八十三张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月1 选择 窗口 光谱 ，打开光谱模块。 2 点击光度计键条中的“连接”来连接仪器。 3 点击光度计键条中“基线”来进行基线的初始化操作。 4 当基线参数对话框弹出时，在开始波长和结束波长中分别输入700和300。5 点击“确定”。 注意在基线校正过

48、程中光度计状态窗口的读数变化。 6 当完成扫描后，点击输出窗口的仪器履历标签。查看列出的基线校正信息。 列出的基线校正履历 第八十四张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月点击菜单栏上的 测定标签选择波长测定的范围、扫描的速度、采样间隔等。试样准备标签，可输入重量、体积、稀释因子、光程长等。仪器参数标签，可选择测定种类（吸收值、透射率、能量、反射率）以及通带（狭逢）等条件。建立数据采集方法第八十五张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月Perkin Elmer Instruments (PE)Varian Analytical Instruments(瓦里安)Beckman Coult

49、er Inc (贝克曼) Shimadzu Scientific Instruments ( 岛津)Agilent Technologies (安捷伦)OceanOptics (海洋光学)国内外生产厂家上海分析仪器总厂上海棱光天美科学仪器有限公司北京普析通用仪器公司北京瑞利分析仪器公司天津光学仪器厂分光光度计的发展与现状第八十六张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月详细操作方法仪器的联机及界面简介1.插上电源，打开光度计前面的电源开关。2.双击计算机桌面UV Probe图标，打开UVProbe软件，点击UVProbe中“Connect”图标联机，出现自检画面。3.如自检完全部绿灯亮，则点

50、击“OK”进入系统。若出现红灯亮，可关掉光度计重新连接，若仍未通过自检，应立即报告仪器负责老师。4.完全通过并进入系统，出现UVProbe菜单栏和工具栏。UVProbe有四大主要模块，包括光谱扫描模块、光度测量模块、时间扫描模块和报告生成器。每种模式都可以直接点击后面的方法设定按钮设置方法。第八十七张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月光谱扫描（Spectrum）1.点下光谱扫描图标，出现光谱扫描界面。2.点击方法按钮，出现方法设置对话框。在此可以设置扫描波长范围，仪器的最大范围为3200190nm。可以设置扫描速度，一般可选中速（Medium）或快速（Fast）进行扫描。采样间隔表示光

51、度计每隔多少nm读一个吸光度值，如没有特殊要求，选择自动即可。可选择是否重复扫描曲线，若重复则设置重复次数和间隔时间。3.点击“Sample Preparation”输入样品信息。包括样品的质量、体积、稀释倍数和测量光程等。也可以输入样品的其他信息。4.点击“Instrument Parameters（仪器参数）”设置测量方式和仪器的一些参数。在测量模式中可选择“Transmittance（透过率）”、“Absorbance（吸光度）”、“Energy（能量）”和“Reflectance（反射）”，其中Reflectance一般用积分球测定固体样品时使用。狭缝设置在3200800nm下设为5n

52、m，在800190nm 设为2nm。若包括这两个范围的波长如1500500nm则选择狭缝为5nm。5.换灯和检测器可根据所测样品进行设置，换灯在393282nm范围内任意值均可，换检测器在895750nm范围内任设一个值即可。但换灯和检测器由于仪器进行机械的移动，会造成信号波动较大，称仪器噪音大，此时所得扫描曲线误差较大，所以所设波长应该避免在样品吸收峰位置以免影响测定值。第八十八张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月6.所有参数设置完成后，两个样品架均不放置样品或两个均放上同样的空白溶液，点击“Baseline”，开始进行基线校正，仪器扫描完成后，点击“ Go To WL”将波长转到7

53、50nm，点击“Auto Zero”把750nm的波长设为0。点击“Start”再次扫描，若得出曲线最值均小于0.001，则认为基线平坦，若数值较大，则将750nm吸光度设为0重新进行基线扫描。7.基线校正完成后，取出样品架的空白溶液，放入样品溶液，点击“Start”开始扫描曲线。扫描完成后，出现保存路径框和文件名框，设置好后出现扫描曲线。8.曲线扫描完成后，在谱图上点击鼠标右键，出现快捷菜单。点击“Auto Scale”可是软件自动调节图像坐标使之适合扫描所得数据。点击“Cross HairDisplay”鼠标显示为交叉线，用鼠标将交叉线放到曲线上某点即可显示该点的波长和吸光度值。9.点击“

54、Label”可以在谱图上添加标签，可在其中输入文本以标记谱图。点击“Legend”出现各数据保存图，若在前面框里勾选该光谱数据，则在左面重叠图上显示其曲线。10若从右键快捷菜单中选择“Customize（自定义）”，可以自定义曲线显示颜色还可定义坐标轴的数值。第八十九张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月11.得出曲线后可以对谱图进行一系列的处理。(1)点击“Data Print（显示数据）”图标可以将谱图曲线直接显示为数值。(2)点击“Manipulate（运算）”图标，可以进行加减乘除、差谱、扣除空白、倒数光谱、对数光谱等处理。(3)点击“Peak Point（显示峰值）”按钮显示“

55、波峰”和“波谷”的数值。(4)点击“Point Pick”图标，输入要显示的波长值，立即显示出所输入波长处的吸光度值。(5)点击“Peak Area”，设定峰阈值，即显示大于此阈值的峰区域。(6)点击“Sewing box（裁缝）”图标，可以进行谱图的裁剪和缝合。12.光谱曲线扫描完成后数据实际直接保存在内存中，并没有保存到硬盘上，此时若关闭窗口，电脑会提示“Some Spectrum data has not been saved! Do you still want to exit and lost unsaved change？（还有光谱数据尚未保存，你是要离开而不保存数据吗？）”选择“

56、No”返回主界面保存所有数据。第九十张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月光度测量（Photometric）1.点下“Photometric”图标，出现光度测量的选择图标和方法设置按钮。2.点击“Method”按钮设置方法，在“Wavelength（波长选择）”中选择点测量（Point）或范围（Range）测量。范围测量可以选择以某一段波长范围内的峰值、谷值、最大、最小或面积值作为标准曲线的点。3.以“Point”为例，点击“下一步”，在“Type”中选择单点、多点曲线。在“Formula（公式）”中选择“Fixed Wavelength”（固定波长）、并选择浓度单位。4.在对话框中选择

57、数据获取方式，可以通过仪器测量，也可通过手动输入值。在“Sample”中输入每种相同浓度的标准溶液的个数（如每个样品都重复一次，则输入“2”），注意这里所说的Sample（样品）表示作标准曲线的样品，而不是将要测定的未知样。5.点击“下一步”，同4一样设置未知样的个数。6.点击“下一步”输入样品保存路径文件名、标题、分析者以及对实验的注释。第九十一张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月7.点击“完成”完成对方法的设定。出现方法对话框，以后点击工具栏的也可出现此对话框，并可以直接修改参数设置。8.填充标准表。点击标准表的任何位置激活标准表。，在表中输入“Sample ID（样品ID）”和“

58、Conc（浓度）”，点击空白框出现下一行。数据来源若选择“User Entry（用户输入）”则可以在 “WL800”等列内输入吸光度值。若选择的是“Instrument（仪器测量）”则只能输入样品ID和浓度。9.输入完成后，可以读取标准样品的数据。将标准样品依次放入样品室。点击“Read Std”开始测量。（注：当显示下列信息时，请点击“确定”。“There is no associated blank for this standard. Do you wish to continue(该标准物相应的空白，是否继续)？”）。分光光度计将分别测定个波长的吸光度值，UVProbe将自动添加所测各

59、值和计算结果与标准表中。10.可以改变曲线级数，同时曲线形状发生改变。点图标，选“Calibration ”，在其中的“Order of”后的下来框中选择需要的级数。第九十二张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月11.选择“FileSave As”输入文件名保存标准表。12.同输入标准表的方法，在“Sample Table（样品表）”中输入样品ID。13.点击“ Go To WL”设置测量需要的波长，点击“Read Unk”测定未知样，如此反复，测量所有的未知样值。 浓度由标准曲线获得。14.得出标准曲线后，在曲线图上点击右键，选择“Properties（属性）”出现统计（Statist

60、ics）显示框。勾选要显示的选项，在标准曲线的左下方即显示对应的统计结果。15.对标准曲线进行四则运算和倒数、对数、A/T转换。在工具栏里点击按钮，在“Arithmetic”中进行“加减乘除”等操作。在“Transforms（转换）”框中进行倒数、对数、A/T转换。在“Column Name”中输入列名，在“Source Column”中选择要进行转换的数据行。在“Operator”中选择转换方法，其中倒数为“1/Y”、对数为“Log 10”、A/T转换为“AbsT TAbs”。16.点击，在出现的界面上选择可以自定义公式进行计算。第九十三张，PPT共一百零一页，创作于2022年6月动力学测量