分析化学色谱分析法

1、分析化学色谱分析法第1页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一 色谱法的分类和发展 色谱过程和基本原理 基本类型色谱方法及其分离机制 色谱法基本理论第2页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一 高分离效能 高灵敏 高选择性 分析速度快 应用范围广色谱法的特点:第3页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一色谱学的重要作用诺贝尔化学奖：1948年，瑞典Tiselins，电泳和吸附分析；1952年，英国马丁(Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。应用的科学领域：生命科学、材料科学、环境科学等。（科学的科学）药学（药物分析）：各国药典收载了

2、许多色谱分析方法。中国药典二部，700多，纯度检查、定性鉴别或含量测定，一部，600多鉴别或含量测定。第4页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一 第一节 色谱法的分类和发展一、色谱法的分类按流动相的分子聚集状态分类:GC、LC、SFC 等。按固定相的分子聚集状态分类:GSC、GLC、LSC、LLC等。第5页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一按操作形式分类:柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等。按色谱过程的分离机制分类:分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法、毛细管电泳法等。第6页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一毛

3、细管电色谱法（CEC）色谱法GSC液相色谱法 （LC）柱色谱法平面色谱法毛细管电泳法 （CE）LLCLSCSECIECBPC纸色谱法薄层色谱法（TLC）LLCLLCLSC气相色谱法（GC）柱色谱法GLC超临界流体色谱法 （SFC）第7页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一二、色谱法的发展 （一）色谱法的历史 （二）色谱法的现状和发展趋势 1新型固定相和检测器的研制 2色谱新方法的研究 3色谱联用技术 4色谱专家第8页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一第二节 色谱过程和基本原理 一、色谱过程实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stat

4、ionary phase)和流动相(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。第9页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一第10页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一色谱过程 组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。第11页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一二、色谱流出曲线和有关概念色谱流出曲线是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。 基线是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器 (主要是检测器) 的噪音随

5、时间的变化。色谱峰是流出曲线上的突起部分。正常色谱峰、拖尾峰和前延峰第12页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一对称因子fs (symmetry factor) ： 衡量色谱峰的对称性 第13页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一到20页到19页第14页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一保留时间(retention time;tR)：从进样到某组 分在柱后出现浓度极大时的时间间隔。死时间(t0)：分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。 调整保留时间( )：某组分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附

6、）的组分在柱中多停留的时间。 定性参数1第15页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一定性参数2 保留体积(VR)：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。 死体积(V0)：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。固定相颗粒间间隙、导管的容积、检测器内腔容积的总和。第16页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一定性参数3调整保留体积(adjusted retention volume)：由保留体积扣除死体积后的体积 相对保留值(r) ：两组分的调整保留值之比注意：VR是定值，tR与FC成反比第17页，共97页，2022年，

7、5月20日，10点44分，星期一定性参数4 保留指数(retention index；I) : 在GC中，以正构烷烃系列作为组分相对保留值的标准，用两个保留时间紧邻待测组分的基准物质来标定组分，这个相对值称为保留指数，又称Kovats指数，定义式： z与z+n为正构烷烃对的碳原子数 ，Z为6，7，8，I为600，700，800第18页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一定量参数峰高(peak height；h)：组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。 峰面积(peak area；A)：色谱曲线与基线间包围的面积。 返回第19页，共97页，2022年，5

8、月20日，10点44分，星期一返回柱效参数标准差(standard deviation；)：正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即0.607倍峰高处的峰宽之半。的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。越大，组分越分散；反之越集中。半峰宽(W1/2)：峰高一半处的峰宽 W1/2=2.355 峰宽 (peak width；W)：色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。 W=4 或 W=1.699W1/2 第20页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一总分离效能指标分离度(resolution；R)：又称分辨率。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。第21页，共97页，

9、2022年，5月20日，10点44分，星期一分离度设正常峰，W1W2= 4 ，则R=1.5时，99.7%面积(tR 3)被分开， tR =6 ，称 6 分离 。第22页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一三、分配系数与色谱分离(一) 分配系数和容量因子 分配系数 (distribution coefficient；K)是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相 (s) 与流动相 (m) 中的浓度 (C) 之比。分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（和压力）有关。是组分的特征常数。第23页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一容量因子(cap

10、acity factor；k)：在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。（摩尔数？） 又称为质量分配系数或分配比。分配系数与色谱分离还与固定相和流动相的体积有关。容量因子与分配系数的关系第24页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一分配系数与色谱分离（二）分配系数和容量因子与保留时间的关系tR=t0(1+ k) tR=t0(1+K ) v=L/tRu=L/t0第25页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一（三）色谱分离的前提KAKB 或kAkB 是色谱分离的前提。 = t0(1+KA ) = t0(1+KB ) tR= t

11、0 (KAKB) tR0 KAKBkAkB分配系数与色谱分离推导过程：第26页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一第三节 基本类型色谱方法及其分离机制分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法第27页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一一、分配色谱法第28页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一分配色谱法 分离原理 利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。 溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质 (种类与极性) 有关；在GLC中K与固定相极性和柱温有关。 第2

12、9页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一分配色谱法固定相 又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。流动相 气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。 液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。 正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定 相的极性。 反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定 相的极性。第30页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一分配色谱法洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。 正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。（库仑力和氢键力）。反相液液分配色谱：极性强的

13、组分先出柱。第31页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一二、吸附色谱法分离原理 利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。吸附过程是试样中组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程 。第32页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。第33页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一吸附色谱法固定相 多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。硅胶表面硅醇基为吸附中心。经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅 胶和堆积硅珠。气

14、相色谱：高分子多孔微球等第34页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一吸附色谱法流动相 有机溶剂（硅胶为吸附剂）洗脱能力：主要由其极性决定。强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。Snyder溶剂强度o：吸附自由能，表示洗脱能力。o值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。第35页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一表 16-1 一些溶剂在硅胶上的o值溶剂溶剂强度（o）溶剂溶剂强度（o）正戊烷0.00甲基特丁基醚0.48正己烷0.00醋酸乙酯0.48氯仿0.26乙腈0.52二氯甲烷0.40异丙醇0.60乙醚0.43甲醇

15、0.70第36页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一洗脱顺序 ka=KaSa/Vm在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。 吸附色谱法第37页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。基本母核相同，引入的取代基极性越强，则分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越多，分子极性越强 (但要考虑其他因素的影响) 。不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸附力越强。分子中取代基的

16、空间排列 第38页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一分离原理 利用被分离组分离子交换能力的 差别而实现分离。分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。阳离子交换：阴离子交换：离子交换通式： 33+RNR+OH-ClRNR+ClOH交换再生交换再生+3+RSOH+Na+Na+3HRSO三、离子交换色谱法第39页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一第40页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一离子交换色谱法交换反应的平衡常数即选择性系数：KA/B是离子对树脂亲和能力相对大小的度量，KA/B越大，A的交换能力大，越易保留。常选择某种离子（如H

17、+或Cl）作参考。 KA、 KB为A、B的分配系数。第41页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一离子交换色谱法固定相 离子交换剂(ion exchanger)：离子交换树脂（resin）和硅胶化学键合离子交换剂。离子交换树脂: 有网状骨架及可离解、可交换基团，如磺酸基 (SO3H) 、羧基 (COOH) 及季胺基 (NR3+OH) 等。性能指标常用交联度、交换容量和粒度等。化学键合离子交换剂：键合在薄壳型和全多孔微粒硅胶上。用于HPLC中的固定相第42页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一离子交换色谱法 流动相一定pH和离子强度的缓冲溶液，有时也加入少量

18、有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以提高选择性。 第43页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一离子交换色谱法影响保留行为的因素被分离离子、离子交换剂、流动相的性质等(1) 离子的电荷和水合半径：价态高选择性系数大。同价阳离子在酸性阳离子交换剂上,水合离子半径, 选择性系数小。稀溶液中阳离子在强酸性阳离子交换树脂上的交换顺序是：Fe3+Al3+Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Mg2+Zn2+Mn2+Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+ 第44页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一离子交换色谱法常见阴离子在强碱性阴

19、离子交换树脂上的交换顺序通常为：柠檬酸根PO43SO42I SCN Cl CH3COOOHF保留顺序？洗脱顺序？第45页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一离子交换色谱法(2)离子交换剂的交联度和交换容量:在一定的范围内树脂的交联度越大，交换容量越大，则组分的保留时间越长。 (3)流动相的组成：交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能力。流动相的离子强度高，使组分的保留值降低。流动相的pH：溶质的离解受到抑制则保留时间变短。弱离子交换树脂的交换容量在某一pH值有极大值。第46页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一四、空间排阻色谱法分离原理根据被分离组分

20、分子的线团尺寸进行分离。也称为分子排阻色谱法。第47页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一空间排阻色谱法根据空间排阻（steric exclusion）理论，孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：渗透系数： Kp =Xs/Xm （0Kp1 ）由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内，Kp与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。第48页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一空间排阻色谱法固定相多孔凝胶：软质、半软质和硬质 主要性能参数平均孔径排斥极限（Kp=0）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量 分子量范围：排斥极限（Kp

21、=0）与全渗透点（Kp=1）之间的分子量范围围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。第49页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一空间排阻色谱法流动相 要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱gel filtration chromatography；GFC)；非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相 (凝胶渗透色谱gel permeation chromatography；GPC)。第50页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一空间排阻色谱法保留体积与渗透系数的关系VmV0分子线团尺寸

22、（分子量）大的组分，其渗透系数小，保留体积也小，因而先被洗脱出柱。第51页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一小结色谱过程方程式：分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。第52页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp，Vs分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。小结第53页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一第四节 色谱法基本理论 第54页，共97页，20

23、22年，5月20日，10点44分，星期一要使R大，必须：1、tR大- k大-热力学2、W小-峰展宽小-动力学第55页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一色谱理论包括两方面:热力学理论：研究分配(分离)过程，塔板理论（plate theory）。动力学理论：研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理论（rate theory）。第56页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一一、塔板理论 始于马丁（Martin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。 第57页

24、，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一塔板理论假定：在色谱柱内每一“塔板”H内，组分在两相间瞬间达到分配平衡。流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。分配系数在各塔板内是常数。纵向扩散可以忽略。第58页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一（一）质量分配和转移 1、单一组分B（kB=0.5）的分配和转移 设色谱柱的塔板数n=5，即r=0、1、2、3、4（或n-1）号。 将单位质量的B加到第0号塔板上。分配平衡后，0号塔板内ms/mm0.333/0.667。进入一个塔板体积的流动相（一次转移），第59页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星

25、期一第60页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一经过N次转移后，质量分布符合二项式(ms+mm)N的展开式。 如N=3，展开式为：(0.333+0.667)3=0.037+0.222+0.444+0.296 0 1 2 3号在固定相和流动相中的质量分布由k(K)决定第61页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一转移N次后，第r号塔板中的质量Nmr： 第62页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一例：转移3次后，在第2号塔板内的溶质分数第63页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一 组分B(kB=0.5)在n=5的色谱柱内

26、及出口的分布 N r 0 1 2 3 4 柱出口 0 1 0 0 0 0 0 1 0.333 0.667 0 0 0 0 2 0.111 0.444 0.445 0 0 0 3 0.037 0.222 0.444 0.296 0 0 4 0.012 0.099 0.269 0.395 0.198 0 5 0.004 0.041 0.164 0.329 0.329 0.132 6 0.001 0.016 0.082 0.219 0.329 0.219 7 0 0.006 0.038 0.128 0.256 0.219 8 0 0.002 0.017 0.068 0.170 0.170 9 0 0

27、 0.007 0.033 0.102 0.114 10 0 0 0.002 0.016 0.056 0.068第64页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一注意：1、柱出口处的质量分数的计算。2、质量（浓度）最大点的N，即保留体积。第65页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一2、两组分的分离A(kA=1)和B(kB=0.5)两组分第66页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一 组分A(kA=1)在n=5的色谱柱内和出口的分布 N r 0 1 2 3 4 柱出口 0 1 0 0 0 0 0 1 0.5 0.5 0 0 0 0 2 0.25

28、0.5 0.25 0 0 0 3 0.125 0.375 0.375 0.125 0 0 4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0 5 0.032 0.157 0.313 0.313 0.157 0.032 6 0.016 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079 7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118 8 0.004 0.032 0.111 0.220 0.274 0.137 9 0.002 0.018 0.072 0.166 0.247 0.137 10 0.001 0.010 0.045 0.094 0.20

29、7 0.124 第67页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一结果： 组分B: k=0.5, 当N=6和7时，柱出口产生B的浓度最大点。 组分A：k=1，N=8和9时，柱出口处达到浓度最大点。两组分开始分离，k小的组分B在柱后先出现浓度极大值, 即先出柱。第68页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一 一根色谱柱n=103以上，组分有微小的分配系数(容量因子)差别即可实现完全分离。 分配系数(容量因子)不等是分离的前提。第69页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一(二) 流出曲线方程1.二项式分布曲线以组分A在柱出口处的质量分数对N作图。

30、第70页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一N 柱出口0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0.032 6 0.079 7 0.118 8 0.137 9 0.137 10 0.124 k=1的组分从n=5色谱柱中的流出曲线图第71页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一2.色谱流出曲线 当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布曲线。第72页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一第73页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一3、色谱流出曲线方程（正态分布方程）描述组分流出色谱柱的浓度变化：为标准差，tR为保留时间，C为

31、任意时间t时的浓度，C0为峰面积A，即相当于某组分的总量。第74页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一t=tR时，C有极大值：Cmax即流出曲线的峰高h。一定时， 峰高h取决于C0。C0一定时， 峰高h取决于。第75页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一 流出曲线方程的常用形式：不论ttR或ttR时，浓度C恒小于Cmax。C随时间t向峰两侧对称下降。越小，峰越锐。 是柱效的标志。第76页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一色谱峰面积以A代替C0，h代替Cmax，且W1/2=2.355 ，峰面积:A = h(2)1/2A=1.065W1

32、/2h 色谱定量的参数第77页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一(三) 理论塔板高度和理论塔板数 (height equivalent to atheoretical plate或plate height, H) (plate number, n) 是色谱柱效参数。第78页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一理论塔板数与标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间的关系：第79页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一理论塔板高度H =L/n 注意：1.计算n时使标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间单位一致 2.n的单位第80页，共97页，2022年，

33、5月20日，10点44分，星期一例在柱长2m、5%阿皮松柱、柱温100、记录纸速为2.0cm/min的实验条件下，测定苯的保留时间为1.50min，半峰宽为0.10cm。求该柱的理论塔板高度和每米的理论塔板数。第81页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一每米理论塔板数为：2.4103/2=1.2103(m1)解：第82页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一有效理论塔板数和有效理论塔板高度Hef =L/nef第83页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一塔板高度的统计概念：单位柱长引起的分子的离散度H=2/L 2HL 是组分分子在色谱柱内离散的度量2是总的离散程度，即单位柱长内分子离散的累积第84页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一小结塔板理论解释了流出曲线的形状说明了组分的分配和分离过程提出了评价柱效的指标但某些假设与实际色谱过程不符 第85页，共97页，2022年，5月20日，10点44分，星期一二、速率理论塔板理论的不足： 组分在两相中不可能真正达到分配平衡； 组分在色谱柱中的纵向扩散不能忽略; 没有考虑各种动力学因素对传质过程的影响； 无法解释柱效与流动相流速的关系； 不能说明影响柱效有哪些主要因