分子生物学检验：核酸序列分析

1、核酸序列分析 核酸是生物遗传的物质基础，核酸分脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）两类，核酸的一级结构是指核苷酸的排列顺序，由于核苷酸间的差异主要是碱基的不同，因此也称为碱基序列。 RNA与DNA的差别是嘧啶成分为胞嘧啶和尿嘧啶而不含胸腺嘧啶。核酸由磷酸二酯键连接形成多聚核苷酸，核苷酸的连接具有严格的方向性，前一位核苷酸的3-OH与下一位核苷酸的5磷酸间形成3，5磷酸二酯键，构成一个没有分支的线性大分子，其两个末端分别称为3末端和5末端。 DNA和RNA对遗传信息的携带和传递就是依靠核苷酸中的碱基排列顺序不同

2、来实现的。可见测定和分析核酸序列对于了解生物个体的千差万别，对于人类各种疾病的诊断和治疗是十分重要的。 在进行核酸测序之前，应该根据测序的目的，待测核酸片段的大小，测序的精确度，待测核酸片段的数量和质量，以及实验室的设备、仪器等条件制定一个总体的测序策略。核酸测序策略比较常用的方法有以下3种：1.随机法：又称鸟枪法。将待测DNA用酶切或超声波随机切割成长短适宜末端又相互有重叠的小片段。长链DNA片段在超声波处理前，最好预先环化。在超声波处理时，环化的DNA片段被打断的随机性好，可以产生一组相互重叠的DNA小片段。 用核酸酶I随机切割待测DNA，可以产生一组相互重叠的DNA小片段，用聚丙烯凝胶电

3、泳分离这些DNA片段，回收大小600个 碱基左右的适合测序的DNA片段。用DNA聚合酶修补其末端，与载体重组，形成亚克隆。亚克隆扩增后，再对其克隆片段进行测序。并将所得资料输入计算机，通过计算机处理最终可以获得待测DNA全序列。 一般随机测序，真正要测的序列通常会比待测DNA实际序列多4到6倍。因为在大多数情况下，要到90%左右的序列测出来之后，才能得到单一的能够连在一起的一段序列。由于有些小片段会多次出现，而另一些小片段又可能未出现。这种结果在所难免，因此采用随机法对大片段DNA测序，其结果可能会不太完整。2.渐进法：将待测大片段DNA克隆于载体，利用通用引物测定DNA片段两端序列，然后根据

4、已测出的核酸序列设计引物，向前继续测序，逐渐获得待测DNA全序列。该方法的优点是构建亚克隆及整个测序过程，可以是逐步推进的方式进行。缺点是要合成许多引物，另外如果待测DNA中有多次重复序列时，会影响测序结果。3.嵌套缺失法：用2种不同的限制性核酸内切酶将待测DNA片段的重组体切断，其中一端可以产生平端，而另一端可以产生3突出端。核酸外切酶可以催化从平端逐一切除5单核苷酸，而对3突出端没有活性。用S1核酸酶及DNA聚合酶对已消化的DNA进行修补，再用DNA连接酶重新形成环化重组体，这样就可以得到一套缺失长度不同的DNA片段克隆。将各个克隆用于测序，从各个片段的缺失端开始测序，测序采用同一引物，测

5、定结果从亚片段序列相互重叠的部分可以将相邻片段的序列彼此拼接，这样通过综合嵌套就可以测出大片段DNA序列。 DNA链末端终止法也称为Sanger法。1977年由分子生物学家F.Sanger发明。这是一种简单快速的DNA测序方法。它的基本原理是利用4种2，3-双脱氧核苷酸（ddNTP）取代脱氧核苷酸(dNTP）作为底物进行DNA合成，由于ddNTP没有3-OH基团，不能与下一个核苷酸反应形成磷酸而酯键，DNA合成反应就会终止。链末端终止法 测定反应分为4组，在每一反应管中加入待测DNA模板、引物DNA聚合酶，用32P或35S标记的一种dNTP，反应适当时间后，每一反应管中分别加入4种ddNTP的

6、一种，反应产物是不同长度的DNA片段，他们具有相同的5末端，而3末端的ddNTP取代处终止。经聚丙烯凝胶电泳分离，发射自显影就可以测出一段DNA序列来。链末端终止法测序主要实验步骤：1.引物合成： 商品合成的多为通用引物，一般为20个碱基左右长度的核苷酸多聚体。为了便于保存和运输，引物多为冻干粉剂，使用时需用TE(10mmol/L TrisCl,1 mmol/L EDTA,pH7.4)溶解成2g/ml的浓度。实验室也可以根据自己的需用合成引物，实验室合成的引物也应溶解成2g/ml的浓度并贮存于-20。2.M13载体系统及测序DNA载体的制备： M13噬菌体有mp18和mp19两个载体，分别含1

7、3个不同的多功能酶切位点，可以作为外源DNA插入区域。在细菌体内M13是双链形式，可以克隆载体。在细菌体外以单链形式存在，可作为测序模板。M13载体系统插入了-半乳糖苷酶基因的调控序列及N端146个氨基酸的编码序列。由于宿主菌缺乏-半乳糖苷酶基因，它所编码的多肽链没有酶的活性。空载体感染细菌后可以可以产生-半乳糖苷酶N端146个氨基酸片段与宿主的缺陷的-半乳糖苷酶结合，形成有活性的酶。而如果有外源DNA片段插入则会破坏N端片段的合成，不能形成有活性的酶。利用M13载体系统这一特性，可以用于蓝白斑筛选，可得到克隆体。 小规模带有待测DNA片段单链M13噬菌体的制备：用培养感染的细菌2ml，高速离

8、心，取上清液用聚乙二醇沉淀，可制备约20g单链DNA。小规模制备的单链M13噬菌体DNA可以用于10个左右的反应系统。3. dNTP的放射性标记： DNA测序反应用32P或35S标记的dNTP来进行。32P发射强粒子，会影响所读取的序列，另外32P标记的序列反应保存期短，分辨率较差。35S发射弱粒子反应保存期长，分辨率较好，但35S半衰期长。随着DNA测序的改进，现在都用荧光染料代替同位素进行DNA标记。4.聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳： 核苷酸序列分析的数量和质量都取决于聚丙烯凝胶的质量，末端终止法测序反应所产生的放射性标记核苷酸片段，均要通过凝胶电泳进行分离，经放射自显影读片才能显示。在最佳

9、条件下，可从变性聚丙烯酰胺凝胶中获得300-400核苷酸的可靠序列。但是，如果要对小量测序反应产物分别按照不同时间进行电泳，则必须小心配制凝胶才能得到高分辨率的序列结果。 用于配胶的丙烯酰胺浓度取决于待测DNA片段的长度。一般400核苷酸的分析以6%的丙烯酰胺凝胶为宜。而序列更长的核苷酸的分析，则可用4%或5%的聚丙烯酰胺凝胶来测定。 凝胶的标准长度一般为40-50cm，但也有些装置能够容纳长100cm的凝胶，不过，长胶很难处理，并且要特殊的大容器固定。凝胶的宽度以20cm较好，可以容纳40个泳道进行电泳。凝胶的标准厚度是0.3-0.4mm。更薄的凝胶可以获得更好的分辨率，但却比较容易破裂。更

10、厚的凝胶更适宜用于体积更大的样品，但却更难固定和干燥。 一般测序凝胶的厚度是均匀的，在这种凝胶中，DAN片段的长度与迁移率之间成对数关系，因此在凝胶的底部会产生间隔较疏的条带，而在凝胶的顶部产生较密集的条带。为解决上述问题可采用契形凝胶。其底部较厚约0.6mm，顶部较薄约0.25mm。契形凝胶可以通过降低电阻并因而减少单位产度的电压降，从而压缩邻近DNA条带之间的空隙。但是契形凝胶容易破裂。另一种解决DNA条带间隙问题的方法是渐进提高凝胶下部的缓冲液浓度。因为通过凝胶的电压将随离子强度的提高而降低，因此DNA越接近凝胶底部，泳动就越慢。这样就可以减少邻近DNA条带的间隙并使从单块凝胶上可以读取

11、更多的核苷酸。 测序凝胶可以用两种加样槽，一种是在丙烯酰胺溶液聚合前将塑料模片插入溶液的顶部形成加样孔。从凝胶中抽出膜片以后，可用缓冲液冲洗加样槽，除去未聚合的丙烯酰胺，然后再加入样品。因此样品被加样槽之间的聚丙烯酰胺指状凝胶相互分隔。 在凝胶聚合以后插入鲨鱼齿梳子，也可以形成加样槽。鲨鱼齿上的各点可以作为防止邻近DNA样品的相混，这样可以减少加样槽的变形，可以产生一个更平整的加样面。由于鲨鱼齿梳子实际上没有在相互邻近泳道上留有间隙，因此有利于准确读取序列。 在电泳过程中，随着凝胶的发热将形成一个温度梯度。凝胶的中心比边缘更热，因此使DNA条带变弯。一般采用电泳缓冲液来冷却凝胶的背面，使凝胶在

12、电泳时不至于温度过高。5.测序凝胶的放射自显影和读取DNA序列： 凝胶电泳结束后，需将凝胶小心取下，对凝胶进行固定、干燥和压片，进行放射自显影。早期的读取DNA序列是采用人工的方法，必须经过较长时间实践才能掌握技巧，存在一定的主观性。现在自动化测序，这一步已经被仪器所取代。链末端终止法测序原理 利用不对称PCR方法产生单链并采用双脱氧链终止法测序法的技术。首先建立4个独立的扩增反应系统。分别包括相同的引物和4种ddNTP。每个扩增反应包括三个步骤：待测DNA的变性，32P或35S标记的测序引物与之结合，在TaDNA聚合酶的作用下链延伸和ddNTP的终止反应。这样获得的产物为一条全长的模板链和一

13、条互补的不完全链。由于引物无法使在上一次被终止链继续延伸。不过引物仍可以使未被终止的链延伸。同时每一次的循环反应又可以获得一些新的被终止链。经过15-40个左右的循环，就可以得到许多不同长度的带有标记的DNA片段。经变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，再经放射自显影就可以读出待测DNA序列。循环测序法： 自动化测序技术是建立在双脱氧链终止法测序基础上，以自动化的仪器代替人工的方法来进行DNA测序。与传统的人工DNA测序相比，自动化DNA测序用荧光标记代替放射性同位素标记，精密激光束探测取代放射自显影，电脑分析数据取代人工判读来解读DNA序列。因此它具有操作安全、简单和规范，可测序通量大，准确性和重复性好

14、的优点。自动化测序技术 现在常用的自动化测序仪，对于待测DNA片段的大小和类型并没有严格的要求。但不同的待测模板需用采用不同的反应条件，一般来说待测片段越纯，则测序效果越好。当待测模板量多时信号的强度会变的更低。不过可以通过增加亮度和提高染料的分辨率来解决。当待测模板浓度不足时，可以通过增加引物浓度来解决。 测序酶的选择也很关键：天然DNA聚合酶都不太适合用于测序。测序酶应该具有较高的持续DNA合成能力。在高温环境下抵抗失活或被分解的能力是测序酶在现代高技术条件下进行循环测序反应中必须具有的主要特性之一。Taq聚合酶及其改良产品是测序酶的主要选择。测序酶还应该除去DNA聚合酶的3-核苷酸外切酶

15、的能力，及在DNA复制后切掉引物的5-核苷酸能力。 引物荧光标记：每个待测DNA分4管进行，每个反应包括一个不同的荧光标记引物。4个反应混合后加在一个泳道进行电泳。 末端荧光标记：嵌入类似物的能力对双脱氧链终止法测序非常重要，对其荧光染料末端又很高的亲和力的酶，能够利用比较低溶度的荧光染料，这样可以减少荧光染料的用量及减少消除未嵌入荧光染料的难度。测序模板的制备和末端标记： 测序模板可以是单链、双链和PCR产物。另外，5Mbp的基因组DNA片段也可以是测序模板。研究表明，末端荧光染色标记法要优于引物荧光染色标记法，并成为自动化测序的首选。目前常用两套末端荧光染料。一种是加入了二氯罗丹染料（dR

16、hodamine），另一种是加入了BigDyes。这两种末端染料都能很好的适宜DNA聚合酶，也适合多数循环测序条件。可用于任何引物及单链DNA、双链DNA和PCR产物DNA的很多模板的测序。由于反应只需较少的染料，因此对于未嵌入染料的去除比较容易，一般只需乙醇沉淀就可完成。dRhodamine和BigDyes两套末端标记染料已成为自动化测序的首选染料。 板式凝胶放电泳法是目前在DNA的测序中，用得最多电泳方法。早期的电泳技术多为聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。为了适应大规模测序的需要。高速DNA测序技术不断发展，人类基因组大规模DNA测序，已普遍采用板凝胶电泳和激光荧光实时检测法。按照双脱氧链终止法的

17、原理，采用激光诱导荧光进行检测。 毛细管凝胶电泳毛细管具有较高的表面积与体积比，有较好的传热性能。因此毛细管电泳可以使用比板凝胶电泳更高的电场强度。在毛细管凝胶电泳DNA序列分析中由于毛细管内径小，则电场强度比平板凝胶电泳可以提十被以上，能够达到高速及高分辨地分离碱基。进行DNA序列分析关键是要快速、灵敏度高、分辨率好。毛细管凝胶电泳的电泳速度比板式凝胶电泳速度快几十倍，灵敏度和分辨率也优于板式凝胶电泳 在检测器方面， 由于荧光染料对检测器灵敏度要求相当高，因此高灵敏度的荧光探测器显得非常重要。毛细管电泳分离单链DNA片段，用紫外吸收检测，灵敏度较激光荧光法低，但由于其价廉，在很多情况仍采用，

18、双链DNA片段电泳分离，应用紫外检测法则更为普遍。近几年来，国外各研究机构不断探索开发新的检测系统以提高DNA片段的检测效率，如采用半导体近红外激光器，半导体激光时间分辨荧光检测器 ，双光子激发荧光检测器等。1996年PE公司推出了ABI310型毛细管电泳遗传分析仪，由单支毛细管、4种荧光染料标记引物、氲离子激光诱导荧光CCD检测，在2.5小时内可测序600 碱基。自动化测序图谱见自动化测序图谱 自从20世纪90年代中期基因组学研究开始，人们就热衷于对大量的真原核生物进行全基因组测序。 大规模基因组重测序、特定区域测序、宏基因组和泛基因组测序，以及个体基因组学，这些基因组学研究的发展则需要更快

19、速度和更低成本的测序技术。 为了满足这种日益增长的需求，几种非Sanger的超高通量测序系统已于2007年面世。 测序过程主要分为以下4步（1）DNA待测文库构建利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。第二代测序技术（2）FlowcellFlowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个chan

20、nel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对（这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。（3）桥式PCR扩增与变性 桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增，如图4.a所示。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。（4）测序 测序反应使用经改造的DNA聚合酶和带4种不同荧光标记的dNTP。其3 末端带有可化学切割的部分，这样也就

21、是起来终止作用，保证了每个循环只有单个碱基合成。用激光扫描反应板表面，读取每一条模板序列第一个聚合反应上去的dNTP种类。将化学基团切割，恢复3 末端，继续下一个DNA聚合反应。如此反复可以获得100bp以上的序列边合成边测序 焦磷酸测序技术是一种新的DNA测序方法。 焦磷酸测序主要操作步骤包括：DNA文库制备与和illumina的不同，它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增。连接载体，构建单链DNA文库理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的D

22、NA序列，因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。焦磷酸测序技术 测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，接着将磁珠放在一种PTP平板上。这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法来固定每个磁珠的位置，以便检测接下来的测序反应过程。 测序方法采用焦磷酸测序法，将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。 测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成

23、的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，从而导致荧光淬灭，以便使测序反应进入下一个循环。 与传统的测序方法相比焦磷酸测序技术的优点是：快速，在4个小时的时间内可以读出上万个碱基。成本低。简便、高效，该方法不需要建立碱基文库，不需提取质粒和构建克隆体。对于一个微生物物种的测序只需一人通过数天的工作就可以完成。仪器操作较方便。 焦磷酸测序技术

24、的主要应用价值：可以寻找基因组中传统测序方法不能发现的突变。可以用对不同生物同源性的分析，基因组结构概况分析。在临床上可用于鉴定菌株的突变热点，了解细菌抗药性的遗传基础。可用于病毒、RNA及基因文库的测序。Solid技术 Solid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器。它基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序（1）DNA文库构建 片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。链接测序2）Emulsion PCR Solid的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsion PCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有

25、1um。在扩增的同时对扩增产物的3端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。3修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域。Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。3）连接酶测序 这一步是Solid测序的独特之处。它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶，而是采用了连接酶。Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为：3-XXnnnzzz-5。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5末端分别标记了CY5、Texas Red、C

26、Y3、6-FAM这4种颜色的荧光染料 这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。这种测序方法也称之为两碱基测序法。当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号，图6-a和图6-b中的比色版所表示的是第1，2位碱基的不同组合与荧光颜色的关系。在记录下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号，以便进行下一个位置的测序。不过值得注意的是，通过这种测序方法，每次测序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位 在测到末尾后，要将新合成的链变性，洗脱。接着用引物n-1进行第二轮测序。引物n-1与引物n的区别是，二者在与接头配对的位置上相差一个碱基（图6-a. 8）。也即是，通过引物n-1在引物n的基础上将测序位置往3端移动一个碱基位置，因而就能测定第0、1位和第5、6位第二轮测序完成，依此类推，直至第五轮测序，最终可以完成所有位置的碱基测序，并且每个位置