肾阳虚肺纤维化和肺纤维化大鼠肺组织糖皮质激素受体的表达

1、肾阳虚肺纤维化和肺纤维化大鼠肺组织糖皮质激素受体的表达杨礼腾，程德云，方洵，穆茂，聂莉，胡小波【关键词】肺纤维化；,肾阳虚；,糖皮质激素；,受体摘要：目的讨论糖皮质激素受体(GR)RNA在肾阳虚肺纤维化和肺纤维化大鼠肺组织的表达及其意义。方法60只安康SD大鼠，随机分为生理盐水组(NS)、肺纤维化组(BL)及肾阳虚肺纤维化组(RYA)，每组再分成两亚组，每亚组10只,用博莱霉素气管内滴入及腺嘌呤灌胃复制肺纤维化及肾阳虚肺纤维化大鼠模型，于14d及28d取大鼠肺组织,运用组织芯片，通过HE及胶原纤维染色以判断肺炎症及纤维化程度和对肺内胶原蛋白定量，通过原位杂交(ISH)对肺组织GRRNA表达进展

2、定位定量分析。结果14d时，肾阳虚组及肺纤维化组GRRNA表达皆呈上调趋势,但无统计学意义(P0.05)；28d时，BL组GRRNA表达明显上调，与BL组比拟，RYA组GRRNA表达那么明显下调(P0.05)。结论肺组织GRRNA表达的上调是糖皮质激素防治肺纤维化之所以有效的机理之一，而肾阳虚状态下肺纤维化肺组织GRRNA表达下调是临床上许多肺纤维化病人对糖皮质激素不敏感的原因之一，同时，温阳药也极可能具有防治肺纤维化的作用。关键词：肺纤维化；肾阳虚；糖皮质激素；受体Abstrat：bjetiveTinvestigatetheglurtiidreeptr(GR)RNAexpressininlu

3、ngtissuesinpulnaryfibrsisithrenalyangastheniaandpulnaryfibrsisratdelsanditslinialvalue.ethds60healthySpragueDaleyratsererandlydividedinttheNSgrup(NS),thepulnary-fibrsisgrup(BL)andthepulnaryfibrsisithrenal-yangastheniagrup(RYA),everygruphad20ratsanderesubdividedinttsubgrupsby14daysand28daysurses,eahs

4、ubgruphad10rats.Pulnaryfibrsisratdelsereestablishedbybleyin-induedbyayfnedrippinginttrahea,inadditin,pulnaryfibrsisithrenalyangastheniaratdelsasellasaddingadeninebypried-stahneeahday,nday14andday28respetively,theseratserekilledandtheratlungtissuesereaquired;andbyeansftissueirarrayassiatedithputer-pi

5、tureanalysistehnlgy,theseveredegreefinflaatinandfibrsis,llagenquantityinratlungs,ereestiatedbyHEandllagendye,GRRNAexpressineredetetedbyinsituhybridizatinay.ResultsGRRNAexpressininratlungfBLereupregulated(P0.05),hever,thseinRYAerednregulated(versusBLP0.05)nday28;GRRNAexpressinangthreegrupserentsignif

6、iantnday14.nlusinGRRNAupregulatininlungtissueuldbeneftheehanisfglurtiidseffetiveurefrpulnaryfibrsis,andGRRNAdnregulatininlungtissueinrenalyangastheniasyndreuldbenefausefglurtiidsnneffetivetherapyfrpulnaryfibrsis,inadditin,thehinesetraditinalediineitharingYangeffetuldbeeffetivetherapyfrpulnaryfibrsis

7、.Keyrds：Pulnaryfibrsis;Renal-Yangasthenia;Glurtiid;Reeptr肺纤维化的治疗目前临床上仍以糖皮质激素为主，虽有一定疗效，但病情的进展恶化往往难以逆转甚至延缓；肾阳虚证经研究证实主要为下丘脑-垂体-靶腺轴(肾上腺、性腺、甲状腺)功能减退所致，肾上腺轴功能减退致糖皮质激素分泌减少为其主要机制之一1；此外，糖皮质激素只有与其受体(GR)结合方能将信号传递而发挥作用，故明确GRRNA在肾阳虚肺纤维化和肺纤维化大鼠肺组织的表达，对评价糖皮质激素及具温肾壮阳(温阳)作用的中药在肺纤维化防治中的作用和指导其临床应用将具有非常重要意义。1材料与方法1.1材料

8、LPIX450高级数码像机(日本Nikn公司),美国Iageprplus专业图像分析软件系统(美国ediaybernetis公司);del2000，irHybridizatinInubatr杂交箱(美国RbbinsSientifirpratin);GR原位杂交检测试剂盒(武汉博士德生物工程);博来霉素(批号Y32480)15g/支(日本化药株式会社);腺嘌呤(Adenine11003)(北京欣经科生物技术);安康SD大鼠60只,150250g,67周龄,雌雄各半(四川大学华西实验动物中心提供)。1.2方法1.2.1实验动物分组、动物模型的建立24及标本的采集安康SD大鼠60只，雌雄各半，实验条

9、件下饲养1周后分组，先按性别分层后随机分为生理盐水组(NS)、肺纤维化组(BL)及肾阳虚肺纤维化组(RYA)，每组20只，再据14，28d两时相再分成两亚组，每亚组雌雄各5只；大鼠称重后，予速眠新II(1l/kg)大腿外侧肌注麻醉，生效后在无菌操作下于颈前正中切开皮肤23，钝性别离皮下组织及肌肉，暴露气管，用7号针头连1l注射器，于气管环间刺入气管后平行进气管，将针头斜面对着气管前壁缓慢滴入博来霉素(5g/kg)，然后缝合切口，将大鼠直立旋转使药液于肺内分布均匀，放回笼中正常饲养，并从即日起，BL组每天灌胃生理盐水3l，RYA组，那么在BL组根底上每天灌胃腺嘌呤(300g/kg)；NS组气管内

10、滴入生理盐水0.20.3l，并每天灌胃生理盐水3l。所有大鼠分别于第15天和第29天早上89点速眠新II麻醉下取标本。先于腹腔静脉抽血35l，静置15in后3500r/in离心10in，汲取上层血浆于Ep管中，于20保存备用，同时于腹主动脉放血至动物死亡后剖开胸腔将肺完好取出，先观察肺大体情况并称肺重，然后用4%多聚甲醛灌注左肺后剪下左肺下叶于4%多聚甲醛中固定；按肺系数=肺重(g)/体重(g)100%计算肺系数，肺纤维化程度越重，其肺系数就越大；据文献方法24，从肺组织HE染色的病理改变胶原纤维染色及定量对肺纤维化模型进展鉴定，并在此根底上，结合大鼠的整体表现、肾脏的肉眼及显微镜下改变和肾功

11、能及血浆皮质醇的变化对肾阳虚肺纤维化模型进展鉴定。1.2.2效应指标的检测1.2.2.1血浆尿素氮(BUN)肌酐(r)及皮质醇(r)含量测定BUN和r的测定采用比色法，严格按试剂盒说明书操作；r的测定采用放射免疫法，并运用自动计数仪进展测定，严格按试剂盒说明书操作。1.2.2.2组织芯片的制作及相关指标的检测5，6(1)制作:肺组织于4%多聚甲醛中固定8h后制成蜡块，并将28dBL组作两份切片(6)，用于从原位杂交(ISH)程度鉴定组织芯片用。之后按文献方法5,6操作，将所有蜡块用于制作组织芯片，共制作4套组织芯片蜡块，同时相的3组标本放在同一组织芯片块上，每套两个组织芯片蜡块，每个蜡块含30

12、点阵,每点直径2。切片:将组织芯片蜡块于切片机上切片(6)，漂片后粘贴于玻片上于80烘烤3h后室温下保存备用。将备用的组织芯片玻片分别用于HE及胶原纤维染色、原位杂交检测GRRNA。鉴定:肉眼及用胶原纤维染色，观察玻片上各点阵情况，假设点阵上各点完好无缺失那么组织芯片合格。此外，从原位杂交GRRNA定量比拟组织芯片及原蜡块以鉴定组织芯片对原蜡块的代表性。(2)胶原纤维染色:采用显示胶原纤维细胞和肌肉的新染法，按文献方法3进展，结果判断为胶原纤维呈红色，细胞核和血细胞呈绿色，肌肉呈黄色。3GRRNA.表达的原位检测2,3：运用组织芯片，常规脱蜡脱水，在探针杂交前所用的液体皆参加RNA酶的抑制剂E

13、rasl使浓度达0.1%；30%H221份加蒸馏水10份滴加于切片上室温10in，蒸馏水洗3次；切片上滴加3%柠檬酸新颖稀释的胃蛋白酶，室温消化组织芯片5in(石蜡切片10in)，用原位杂交用PBS洗3次各5in，蒸馏水洗1次；室温后固定10in，蒸馏水洗3次；每张切片加20l预杂交液，放于湿盒中于杂交箱中40预杂交2h，汲取多余液体后于每张切片加杂交液20l，盖上封口膜于杂交箱中40杂交过夜；杂交后的洗涤:揭掉封口膜37左右水温的2SS洗5in2次；370.5SS洗15in1次；370.2SS洗15in1次；滴加封闭液于37反响30in，甩去多余液体后滴加生物素化鼠抗地高辛于37反响60in

14、，原位杂交用PBS洗5in4次；滴加SAB于37反响20in，原位杂交用PBS洗5in3次，之后滴加生物素化过氧化物酶于37反响20in，原位杂交用PBS洗5in4次；DAB显色2030in，水洗终止反响，经苏木素复染、盐酸酒精分化及自来水冲洗后脱水、透明、封片。图像采集、处理及分析定量：利用Iageprplus专业图像分析软件系统，于组织芯片上的每点(包括部份石蜡切片)的左右上下四个视野各采集一张100倍的图像用于图像处理及分析，4张图像的平均值代表该芯片上该指标的量，4套芯片上相对应的同一指标的4点再取平均值，代表该大鼠肺组织的该指标的量:HE染色，运用图像分析软件的计数功能对图像上的细胞

15、核进展别离然后自动计数细胞核数，每个细胞核代表一个细胞，并与正常对照组细胞数的均数比拟，其高出的差值越大，示炎症程度越重；胶原纤维染色定量总胶原和原位杂交定量GRRNA，运用图像分析软件先进展颜色别离，然后自动计算其积分光密度(ID)；ID为各个单独探测到的像素光密度的总和，包含了横向的面积和纵向的像素深度，其值越大示所检测指标含量越高，故ID越大示纤维化程度越重，此外，由于图像分析软件不能区分肺组织的不同细胞，故只能肉眼定位，大致判断目的基因表达的分布。1.2.3统计学处理实验数据用SPSS13.0软件行单因数方差分析(ANVA),所测数据以表示。2结果2.1动物表现肺纤维化组(14d及28

16、d)大鼠取食排便活动均减少，肾阳虚纤维化组还表现为消瘦，有的倦缩拱背，毛发松散脱落,口唇苍白,眯眼，尾巴湿冷。生理盐水组活动取食皆活泼。2.2病理改变2.2.1肾阳虚纤维化组双肾肿胀增大，外表见黄色米粒状颗粒弥漫分布，但不突起肺纤维化组和生理盐水组双肾无明显肿胀增大。生理盐水组肺外表光滑，呈粉红色，弹性良好；肺纤维化组及肾阳虚纤维化组肺呈暗红色，体积增大，弹性较差，外表凸凹不平，但肺纤维化组更为明显见。图13。1.NS(28d肺肾)2.BL(28d肺肾)3.RYA(28d肺肾)图1各组大鼠肺肾大体改变比拟略2.2.2肾脏及肺病理光镜观察肾阳虚大鼠肾皮质区大多数肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜细胞

17、增多，肾小球呈分叶状，除见较多异物肉芽肿结节之外，主要病变在肾小管，尤其是近曲小管与间质的炎症、异物肉芽肿、肾小管囊状扩张并有较多纤维化病灶形成。肺纤维化组和生理盐水组肾组织未见异常改变。生理盐水组肺组织构造明晰，肺泡壁未见增厚，肺泡上皮细胞构造完好，胶原染色示无明显胶原沉积。肺纤维化组肺泡间隔显著增宽，肺泡腔变形、闭塞、成纤维细胞及其基质增生，其中有较多的单核细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润，胶原染色示红色的胶原条索状弥漫沉积，交织成网。肾阳虚纤维化组上述改变较轻，但炎性细胞浸润程度照旧；胶原染色示肺泡间隔区域胶原沉积减轻，但支气管壁及其周围仍沉积明显。见图2。2.3各组肺系数肺炎症及纤维化程度比

18、拟14d时，RYA组和BL组肺胶原纤维的沉积及炎性细胞浸润皆非常明显，但二者比拟无明显差异(P0.05)，而肺系数RYA组大于BL组(P0.05)。28d时，RYA组和BL组肺系数、肺胶原纤维的沉积及炎性细胞浸润明显增加(P0.05)，但RYA组肺系数增加更明显，胶原纤维的沉积却较BL组轻(P0.05)，炎性细胞浸润RYA组与BL组无明显差异,与14d比拟，BL组胶原纤维的沉积明显加重(P0.05)，炎性细胞浸润那么加重不明显(P0.05)，RYA组三指标那么无明显差异(P0.05)。见表1。表1各组肺系数肺炎症及纤维化程度比拟略与NS组比拟P0.05;,P0.05;与BL组比拟,P0.05;

19、,P0.05;28d与14d比拟,P0.05;P0.051.NS(28d胶原染色100)2.BL(28d胶原染色100)3.RYA(28d胶原染色100)图图2各组大鼠肺组织胶原沉积程度比拟略1.NS(28dISH100)2.BL(28dISH100)3.RYA(28dISH100)图3各组大鼠肺组织GRRNA表达比拟略2.4各组血浆rBUN及r含量比拟RYA组大鼠血浆r及BUN皆明显升高，r那么明显降低,提示RYA组大鼠肾阳虚形成；BL组三指标那么无明显改变。见表2。表2各组血浆rBUN及r含量比拟略与NS组比拟,*P0.05,*P0.05;与BL组比拟,*P0.05;2.5肾阳虚肺纤维化和

20、肺纤维化大鼠肺组织GRRNA的表达14d时，RYA组及BL组GRRNA表达皆呈上调趋势，但与NS组比拟无统计学意义；28d时，BL组肺组织GRRNA表达明显上调，主要分布于型肺泡上皮及支气管上皮细胞、淋巴细胞及巨噬细胞的胞核胞浆中，而RYA组无明显上调，但与BL组比拟，GRRNA表达那么明显下调。见图3及表3。表3肾阳虚肺纤维化和肺纤维化大鼠肺组织GRRNA的表达略与NS比拟*,P0.05,*P0.05;与BL组比拟P0.05,P0.05;*与*比拟P0.053讨论肺纤维化为肺间质结缔组织代谢失衡而过度沉积所致，目前还未有特效的治疗方法，临床上仍以糖皮质激素治疗为主，虽有一定疗效，但病情的进展

21、恶化往往难以逆转甚至延缓；据研究证实，肾阳虚证的本质主要为下丘脑-垂体-靶腺轴功能减退所致，而温阳中药能改善此轴功能，其中，以肾上腺轴功能减退糖皮质激素分泌减少为主要机制1，据此机制，说明糖皮质激素具有温阳作用，而具有温阳作用的中药也可能具有防治肺纤维化的潜在价值；此外，糖皮质激素只有与其受体结合方能将信号沿受体后信号通路下传而调控靶基因的表达而发挥作用，故我们运用中西医结合之优势，建立了肾阳虚肺纤维化及肺纤维化大鼠模型，并从GRRNA表达的程度来评估温阳中药及糖皮质激素在肺纤维化防治中的价值。据腺嘌呤致肾阳虚和博莱霉素致肺纤维化动物模型相关文献的评价方法24结合客观指标肾功能及血浆皮质醇的改

22、变，说明肾阳虚肺纤维化及肺纤维化大鼠模型复制成功。据PujlL7等研究发现，对糖皮质激素敏感的间质性肺疾病结节病和隐源性间质性肺炎患者肺组织GRalphaRNA的表达明显高于对激素不敏感的特发性间质纤维化的患者，而GRbetaRNA那么无明显差异；但肺纤维化肺组织GRRNA的详细表达情况目前还未完全明了。据我们的实验结果显示，在博莱霉素致大鼠肺纤维化形成过程中，GRRNA在肺纤维化大鼠肺组织的表达于2周时无明显上调，4周时却明显上调,而此时相是以I型胶原纤维沉积为主，这就说明肺组织GRRNA表达的上调是糖皮质激素防治肺纤维化之所以有效的机制之一；此外，大鼠肺组织的炎症反响程度于2周及4周两时相

23、无明显差异，提示肺组织GRRNA表达的上调与肺组织炎症反响程度无明显比例关系，说明糖皮质激素防治肺纤维化的作用并不完全依赖其抗炎作用。据实验结果显示，在大鼠肾阳虚肺纤维化形成过程中,肺组织GRRNA表达无明显上调，提示肾阳虚抑制了肺纤维化肺组织GRRNA表达的上调，即在肾阳虚状态下肺纤维化肺组织GRRNA表达下调；据中医认为，久病及肾，久病必累及肾之阴阳8，故随着肺纤维化病人病程的进展,常常会致肾阳虚之发生，而此时肺组织GRRNA表达下调，这就是临床上许多肺纤维化病人对糖皮质激素不敏感及糖皮质激素未能阻止病程进展的原因之一，当然，肺组织GRRNA表达下调也可认为是肾阳虚证的物质根底之一。此外，经上千年的临床理论已明确温阳药能纠正肾阳虚，现代研究也证实温阳药确能改善下丘脑-肾上腺轴之功能1，正常情况下，糖皮质激素高分泌日久会导致GR的下调，反之亦然，但在肾阳虚状态下，据实