发酵工程8发酵过程控制

1、第八章发酵过程控制本章内容发酵过程控制概述温度对发酵的影响及其控制pH对发酵的影响及其控制溶解氧对发酵的影响及其控制CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制基质浓度对发酵的影响及补料控制通气搅拌对发酵的影响及其控制泡沫对发酵的影响及其控制高密度发酵及过程控制发酵终点的检测与控制自动控制技术在发酵过程控制中的应用发酵过程控制概述1. 过程控制的重要性2. 发酵过程控制的一般步骤3. 参数检测1. 过程控制的重要性过程控制的意义：最佳工艺条件的优选（即最佳工艺参数的确定）以及在发酵过程中通过过程调节达到最适水平的控制。决定发酵单位(水平)的因素外部环境因素工艺条件生物因素设备性能：传递性能菌株特性(营养

2、要求、生长速率、 呼吸强度、产物合成速率)物理：n、T、Ws化学：pH、DO、浓度2. 发酵过程控制的一般步骤 确定能反映过程变化的各种理化参数及其检测方法 研究这些参数的变化对发酵生产水平的影响及其机制，获取最适水平或最佳范围建立数学模型定量描述各参数之间随时间变化的关系通过计算机实施在线自动检测和控制，验证各种控制模型的可行性及其适用范围，实现发酵过程最优控制 3. 参数检测代谢参数按性质可分为三类：生物参数：菌丝形态、菌体浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、摄氧率、关键酶活力等物理参数：温度、搅拌转速、罐压、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、

3、磷）、 pH、产物浓度、核酸量等参数按获取方式可分为两类： 直接参数：如T、pH、罐压、空气流量、搅拌转速、溶氧浓度等间接参数：将直接参数通过公式计算获得的。如摄氧率()、呼吸强度(QO2)、比生长速率（) 、体积溶氧系数(KLa)、呼吸商(RQ)等。参数的测量形式：离线测量：基质（糖、脂类、无机盐等）、前体和代谢产物（抗生素、酶、有机酸、氨基酸等）在线测量：如T 、pH、DO、溶解CO2、尾气CO2、黏度、搅拌转速等优点：及时、省力，可从繁琐操作中解脱出来，便于计算机控制。 困难：传感器要求较高。对传感器的要求：能经受高压蒸汽灭菌；探头材料不易老化，使用寿命长；传感器及其二次仪表具有长期稳定

4、性；最好能在过程中随时校正，灵敏度好；解决探头敏感部位被物料（反应液）粘住、堵塞 问题；安装使用和维修方便；价格合理，便于推广。 温度测量 感温元件：热电偶（温度信号 电信号） 二次仪表：将热电偶输出的电信号转换成 被测介质的温度值参数检测方法搅拌转速和搅拌功率的测量搅拌转速：磁感应式，光感应式， 测速电机；搅拌功率：功率表空气流量测定体积流量型： 会引起流体能量损失，受温度和压力变化的影响； 同心孔板压差式流量计； 转子流量计。质量流量型： 根据流体固有性质（质量、导电性、热传导性能）设计的流量计。罐压测量 压力表 压力传感器 pH测量 复合pH电极 pH测量仪器溶解氧的测量 化学法 极谱法

5、 复膜氧电极法 复膜氧电极示意图（a）极谱型 （b）原电池型细胞浓度的测量 化学法：如DNA、RNA分析等 物理法：如重量分析、分光光度分析、 浊度分析等新技术：以电容法为测量原理的在线 活细胞浓度测量传感器 原位活细胞在线检测仪温度对发酵的影响及其控制1. 影响发酵温度的因素2. 温度对微生物生长的影响3. 温度对基质消耗的影响4. 温度对产物合成的影响5. 最适温度的选择与控制 影响发酵温度的因素(1)发酵热发酵过程中所产生的热量，叫做发酵热。 Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射 (2) 生物热来源 ：微生物对营养物质的分解所释放的能量影响因素：菌株发酵时期培养基成分 生物热与其它参数

6、的关系 呼吸强度QO2 糖利用速率当产生的生物热达到高峰时，菌的呼吸强度最大，糖的利用速率也最大，可用耗氧量、糖耗来衡量生物热。2. 温度对微生物生长的影响当时，可忽略，微生物处于生长状态。、皆与T有关，其关系均可用阿累尼乌斯公式描述：EE 死亡速率比生长速率对温度变化更为敏感。嗜冷、嗜中温、嗜热菌的典型生长与温度关系在其最适温度范围内，生长速率随温度升高而增加，当温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅速下降。 不同生长阶段的微生物对温度的反应不同 处于延迟期的细菌对温度的影响十分敏感。对于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，则升温的破坏作用较弱。

7、处于生长后期的细菌，其生长速度一般主要取决于溶解氧，而不是温度。 Righelato假定：m维持因子，即生长速率为零时的葡萄糖的消耗。m项与渗透压调节、代谢产物的生成、迁移性及除繁殖以外的其它生物转化等过程所需的能量有关。这些过程受温度的影响，所以m也和温度相关。B生长系数，即同一生长速率下的糖耗，B值越大，说明同样比生长速率下，用于纯粹生长的糖耗越大。 改变温度可以控制qs和 3. 温度对基质消耗的影响(1) 糖比消耗速率qs（2）T对B、m和的影响 qs一定：当TTm时， m ， , B 底物转化效率低当T=Tm时，T(K)m温度对B、m和不同qs下对值的影响4. 温度对产物合成的影响影响

8、发酵过程中各种反应速率，从而影响微生物的生长代谢与产物生成。 e.g. 青霉菌发酵生产青霉素 青霉菌生长活化能E1=34kJ/mol 青霉素合成活化能E2=112kJ/mol 青霉素合成速率对温度较敏感改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成 。影响生物合成方向。 e.g. 四环素发酵中金色链霉菌：T5.0：酵母形态变小，发酵液变黑，且污染大量细菌 pH0.5% 低pH6.8控制加糖 7% ， OTR逐渐至OTR=，即 ，高位平衡 当处于高位平衡时，表明供氧性能好。高位平衡通常发生在正常情况的前、后期。平衡点分析：当CL（如对数生长期很大）， ，OTRCm, 卷须霉素: 而有些菌株 Ccr

9、CCr，生产阶段满足CLCm。 （1）发酵异常指标发酵中污染杂菌，溶解氧发生异常变化。对于好气性杂菌，溶解氧会一反往常在较短时间内跌到零附近，跌零后长时间不回升。对于厌气性杂菌，溶解氧升高。污染噬菌体或其它不明原因引起 发酵液变稀，此时溶解氧迅速上升。 操作故障或事故分析 谷氨酸正常发酵和异常发酵的溶解氧曲线正常发酵溶解氧曲线-异常发酵溶解氧曲线异常发酵光密度曲线（2）补料控制指标 中间补料是否得当可以从溶解氧的变化看出。发酵过程中出现“发酸”现象，此时溶解氧很快下降。 （3）代谢方向控制指标 测量溶解氧可以确定CCr、Cm值通过溶氧测量可以掌握由好气转为厌气培养的关键时机 e.g.天门冬酰胺

10、酶发酵：45%饱和度 在酵母以及其他微生物菌体的生产中，溶氧值是控制其代谢方向的最好的指标之一 。（4）设备性能、工艺合理性指标评价设备性能、工艺合理性的最终指标：发酵单位 设备反映供氧性能： 搅拌桨形式 叶片形式 搅拌器直径d 搅拌档数m和搅拌器间距s 档板宽度w和档板数z 通气：空气分布器的类型和位置 n，P/V 设备操作参数 罐压 WS或VVM搅拌设备几何参数（4）设备性能、工艺合理性指标工艺条件反映耗氧和供氧特征菌种性能：耗O2培养基性能：耗O2、供O2温度：耗O2、供O2RQ（O2与CO2水平比较）：耗O2表面活性剂：耗O2、供O2改进工艺：控制补料速度、T 的调节、中间补水、 添加

11、表面活性剂等等 对现有发酵工厂进行技术改造 浅层次 修改设备和工艺 规模和控制水平上档次 引入新型发酵类型 深层次 工艺的改进是否有效可通过溶解氧水平进行评价： P/V的改变对溶解氧和产量的影响 e.g.利福霉素发酵：5080h波谷阶段，P/V，KLa，供氧；3W/L比1 W/L批号的发酵单位增加约900u/ml 搅拌转数n 对溶解氧和产量的影响e.g.赤霉素发酵：15 50h期间，n从155 提高至180r/min， 赤霉素单位（1）溶解氧控制的一般原则 生长阶段： 即可产物合成阶段： 即可过高的溶氧水平反而对菌体代谢有不可逆的抑制作用（2）溶解氧控制作为发酵中间控制的手段之一 控制原理发酵

12、过程中， 糖量 x , QO2 CL 糖量 QO2 CL 补糖使CL下降，而CL回升的快慢取决于供氧效率。对于一个具体的发酵，存在一个最适氧浓度（Cm）水平，补糖速率应与其相适应。 ，加大补糖速率 ，减小补糖速率实现用溶解氧水平控制补料速率 补糖速率控制在正好使生产菌处于所谓“半饥饿状态”，使其仅能维持正常的生长代谢，即把更多的糖用于产物合成，并永远不超过罐设计时的KLa水平所能提供的最大供氧速率。 控制原则（2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一 控制方法 溶氧和补糖控制系统 溶氧和pH控制的系统 （2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一 溶氧在加糖控制上的应用溶氧与pH协同控制系统（3）溶

13、解氧控制的工艺方法：从供氧、需氧两方面考虑 供氧方面：提高氧分压（氧分含量），即 ，提高供氧能力改变搅拌转速：通过改变KLa来提高供氧能力 通气速率Ws ：Ws增加有上限，引起“过载”、泡沫提高罐压： ，但同时会增加CO2的溶解度，影响pH及可能会影响菌的代谢，另外还会增加对设备的强度要求。 改变发酵液理化性质（， ，Ii） 加消泡剂，补加无菌水，改变培养基成分改变KL改变温度： ，提高推动力（C*CL）（3）溶解氧控制的工艺方法（续） 供氧方面：（3）溶解氧控制的工艺方法（续）耗氧方面 限制性基质的流加控制（补料控制）：在OTR一定情况下，控制基质浓度限制、x 限制 控制溶解氧（4）溶解氧自

14、动控制系统改变通气速率的溶氧控制系统 改变搅拌转速的溶氧控制系统改变通气量、转速、罐压所组成的多参数溶氧控制系统溶解氧对被孢霉合成花生四烯酸 (AA) 的影响 溶氧量对AA产量的影响注：摇床转速150r/min, 25 KLa越大，培养基中溶解氧越多, AA合成速度越快溶解氧控制对鸟苷产量的影响不同的DO控制条件下鸟苷积累的比较DO()：5，l0，20，30发酵过程 DO 变化与鸟苷 积累的关系DO 控制在1020，产物积累，鸟苷含量最高。DO在5和30，前期产物积累，但后期基本不增加.DO水平的超高阶段(发酵周期28h44h)，鸟苷积累量基本不增加；调整DO 在适当水平上，鸟苷积累量继续上升

15、。 CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制1. 定义 2. 发酵过程中CO2释放率的变化3. CO2对发酵的影响 1. 定义 呼吸商（RQ）：指菌体呼吸过程中，CO2释放率和菌的耗 氧速率之比，RQ反映菌的代谢情况。菌体耗氧速率 OUR，molO2/Lh 菌体CO2释放率CER，molCO2/Lh（1）影响尾气中CO2浓度的因素 通入空气量： 呼吸强度：CO2溶解度：菌体量：（2）CER变化规律 CO2积累量渐增，与x曲线对应，基本类似S型曲线变化；当工艺和设备参数一定的情况下，CER与x有比例关系（CER菌体生长速率）；CO2浓度变化与O2浓度变化成反向同步关系。CERdt，菌体干重的时间曲线1

16、- CERdt；2-菌量（3）CER的测量与计算 测量方法：热导、红外分析仪、质谱仪计算 （1）研究参数CO2的意义 作为代谢产物或中间前体，尾气中CO2积累与生物量 成正比，通过C质量平衡估算生长速率和细胞量。高浓度CO2对发酵多表现为抑制作用，应实施测量与 控制；尾气CO2不仅直接反映代谢情况，而且和其它参数及补料操作密切相关，可作为工艺优化的指标。 （2）CO2对细胞的作用机制“麻醉”作用 CO2及HCO3-都会影响细胞膜的结构，使膜的流动性及表面电荷密度发生变化，导致许多基质的跨膜运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，细胞生长受到抑制，形态发生改变。 （3）CO2对

17、菌体生长及产物形成的影响 CO2, 基质分解速率，ATP ，中间产物或形态变异导致产量高浓度CO2抑制作用的独立性: 只要CO2在培养液中浓度过量，即使供氧充足（CLCCr），CO2的抑制作用不能解除，这种负作用在放大过程更明显。正确评价通气的作用：供氧：排废气：水分及挥发性组分的散失 （4）CO2释放与发酵过程参数pH及操作参数补糖速率的关系在青霉素发酵中补糖将引起排气CO2增加，同时pH下降。 糖、CO2、pH三者的相关性，被青霉素工业生产上用于补料控制的参数，并认为排气CO2的变化比pH变化更为敏感，所以测定排气CO2释放率 （CER）来控制补糖速率。 补糖与溶氧及pH协同控制补糖速率与

18、CER控制 补糖对排气CO2和pH的影响（4）尾气CO2与O2的相关性 相关程度表示：尾气CO2与O2相关性：反向同步关系呼吸商（RQ）与发酵的关系不同菌株、同一菌株不同代谢途径、同一菌株利用不同基质、同一菌株在不同发酵阶段，RQ值不相同。RQ值可以表征发酵状况。 青霉素发酵不同阶段： 菌体生长阶段：RQ0.909 维持阶段：RQ=1 生产阶段：RQ=4如果产物的还原性比基质大时，其RQ值就增加；反之，当产物的氧化性比基质大时，RQ值就要减少，其偏离程度决定于单位菌体利用基质形成产物的量。 产物形成对RQ影响最大基质浓度对发酵的影响及其控制1. 基质浓度对发酵的影响 2. 补料控制（1） 基质

19、浓度对微生物生长的影响sKS情况下，比生长速率与基质浓度呈直线关系：一般情况下符合Monod方程式基质浓度高时 (2) 基质浓度对产物合成的影响低浓度限制低水平诱导高浓度抑制及分解阻遏作用e.g.葡萄糖氧化酶发酵：葡萄糖用量从8%降至6%，补入2%氨基乙酸或甘油，使酶活力分别提高26%或6.7%。 谷氨酸发酵（乙醇为碳源）：当乙醇浓度为2.5g/L和35g/L时，可延长谷氨酸生产时间，但在更高浓度下，菌体生长受到抑制，谷氨酸产量降低。（1）补料的目的解除基质过浓的抑制解除产物的反馈抑制解除分解代谢物阻遏作用避免因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多而造成波谷现象。在生产上，补料还经常作为纠

20、正异常发酵的一个重要手段。（2）补料的内容 补充微生物能源和碳源 补充菌体所需要的氮源 补充微量元素或无机盐 添加前体、诱导剂等（3）补料的原则中间补料的数量为基础料的13倍 。补料的原则就在于控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。现有的各种补料措施都是通过实验方法确定的。 大多数补料分批发酵均补加生长限制性基质以经验数据或预测数据控制流加；用传感器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流加；以溶氧、pH、RQ、排气中CO2分压及代谢物质浓度等参数间接控制流加；以物料平衡方程，通过传感器在线测定的一些参数计算限制性基质的浓度，间接控制流加。（4）补料控制的策略（5）反馈控制参数的

21、确定为了有效地进行中间补料，必须选择恰当的反馈控制参数，以及了解这些参数与微生物代谢、菌体生长、基质利用以及产物形成之间的关系。 e.g. 谷氨酸发酵 在谷氨酸发酵过程中的某阶段，生产菌的摄氧率和基质消耗速率之间存在着线性关系。K=1.51K=1.75K=2.16谷氨酸发酵中K值对糖浓度的控制的影响（6）补料速率的确定优化补料速率是补料控制中十分重要的一环，补料速率要根据微生物对营养等的消耗速率及所设定的培养液中最低维持浓度而定。补糖速率最佳点与设备的供氧能力有关。 e.g.青霉素发酵：KLa大的设备补料速率相应大些；供氧低的设备，补料速率相应减少，产量比供氧能力好的设备降低23。（7）实例：

22、四环素发酵中的补糖控制补糖时间对四环素发酵单位的影响补糖时间适当 （ 45h后加）补糖时间过晚 （62h开始加） 补糖时间过早 （20h后加） 维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用补糖对四环素发酵的影响 在最适补加葡萄糖的条件下，能正确控制菌丝量的增加、糖的消耗与发酵单位增长三者之间的关系，就可获得比采用丰富培养基时更长的生物合成期。 维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用泡沫对发酵的影响及其控制1. 泡沫的产生及其影响2. 发酵过程中泡沫的消长规律3. 泡沫的控制1. 泡沫的产生及其影响泡沫的产生 通气和搅拌 代谢气体的逸出 存在稳定泡沫的表面活性物质1. 泡沫的产生及其影

23、响泡沫的类型一类存在于发酵液的液面上。这类泡沫气相所占比例特别大，并且泡沫与它下面的液体之间有能分辨的界线。如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见的泡沫。另一类出现在粘稠的菌丝发酵液当中。这种泡沫分散很细，而且很均匀，也较稳定。泡沫与液体间没有明显的波面界限，在鼓泡的发酵液中气体分散相占的比例由下而上地逐渐增加。泡沫的不利影响降低了发酵罐的装料系数 增加了菌群的非均一性增加了染菌机会 大量起泡引起“逃液”，导致产物的损失 泡沫严重时会影响通气搅拌的正常进行消泡剂的加入将给提取工序带来困难1. 泡沫的产生及其影响2.发酵过程中泡沫的消长规律影响因素通气搅拌的强度培养基的配比及原材料组成培养基

24、的灭菌方法和操作条件微生物代谢活动造成发酵液性质变化染菌 霉菌发酵过程中培养液的性质与泡沫的关系3. 泡沫的控制 （1）机械消泡（2）化学消泡 （3）从微生物本身特性着手，防止泡沫形成 筛选不产生泡沫的微生物突变株 几种微生物混合培养 （1）机械消泡原理：靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。优缺点优点：不需引入外来物质，可节省原材料，减少 污染机会，并可减少培养液性质复杂化的程度。缺点：不如化学消泡迅速可靠，需要一定的设备和消耗一定的动力；不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素 （1）机械消泡机械消泡装置的选择依据动力小结构简单 坚固耐用 清洗

25、、杀菌容易 维修保养费用少 机械消泡方法 罐内消泡：耙式消泡桨、旋转圆板式、气流吸入式、冲击反射板式、碟式及超声波等机械消泡装置。罐外消泡：旋转叶片式、喷雾式、离心式及转向板式等机械消泡装置。 （1）机械消泡（2）化学消泡消泡机理当泡沫的表层存在着极性的表面活性物质而形成双电层时，可以加入一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度；或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺液膜上的空间，降低液膜强度，导致泡沫破裂。当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。（2）化学消泡化学消泡的优点来源广泛作用迅速可靠，消泡效

26、率高 不需改造现有设备 容易实现自动控制 消泡剂选择的依据必须是表面活性剂，且具有较低的表面张力，消泡作用 迅速，效率高。对气液界面的散布系数足够大，具有一定的亲水性。在水中的溶解度较小，以保持其持久的消泡或抑泡性能。对发酵过程无毒，对人、畜无害，不被微生物同化，对菌 体生长和代谢无影响，不影响产物的提取和产品质量。不干扰溶解氧、pH等测定仪表使用，最好不影响氧的传递。能耐高压蒸气灭菌而不变性，对设备无腐蚀性影响来源方便，价格便宜。 常用的消泡剂种类天然油脂类:玉米油、米糠油、豆油、棉子油、鱼油及猪油 高碳醇、脂肪酸和酯类:如十八醇、聚二醇 聚醚类:聚氧丙烯甘油,聚氧乙烯氧丙烯甘油（又称泡敌）硅酮类（聚硅油类） 聚二甲基硅氧烷及其衍生物 ：适用于放线菌和细菌发酵 羟基聚二甲基硅氧烷 ：曾用于青霉素和土霉素发酵氟化烷烃: 具有极其小的表面能消泡剂的应用 消泡剂的消泡效果与使用方式密切相关消泡剂的分散可借助于机械方法，也可加入某种称为载体或分散剂的物质，将消泡剂乳化成细小液滴消泡作用的持久性：本身性能，加入量及时机使用天然油脂时应注意一次不能加得太多 消泡剂对细胞的生理有重要的影响 在应用消泡剂之前需作比较性试验消泡剂应制成乳浊液，并且不被同化，消耗最少高密度发酵及过程控制1. 高密度发酵2.高密