禽流感病毒H5N1病毒颗粒中鸡胚宿主蛋白的质谱分析

1、禽流感病毒H5N1病毒颗粒中鸡胚宿主蛋白的质谱分析禽流感病毒H5N1病毒颗粒中鸡胚宿主蛋白的质谱分析1引言论文联盟：包膜病毒是一类在核衣壳外包有脂质双层膜的病毒，包膜来自受感染宿主细胞的细胞膜或核膜。目前认为，成熟的包膜病毒颗粒中除包含其基因组编码的构造蛋白外，还包含多种宿主蛋白1。在病毒颗粒中已发现了系列宿主蛋白25，其中一些蛋白对病毒的复制和包装有重要作用68。流感病毒是一种包膜病毒，其成熟病毒颗粒含有9种病毒基因组编码的构造蛋白。通过蛋白质组学方法可对在Ver细胞中增殖的流感病毒进展分析，发现成熟的病毒颗粒结合有36种宿主蛋白9。目前，此类研究均选择来源于哺乳动物的细胞株作为流感病毒增殖

2、的宿主。在细胞培养技术开展起来之前，研究者多采用鸡胚作为流感病毒增殖宿主。由于本钱低、产量高，鸡胚已成为消费流感病毒疫苗的主要宿主。但是，鸡胚与细胞株在很多方面存在差异。在鸡胚内增殖的流感病毒颗粒结合宿主蛋白的情况尚不清楚，因此有必要对在鸡胚内增殖的流感病毒颗粒所包裹的来源于宿主鸡胚的蛋白进展全面的分析。据此，本研究采用SDS与质谱分析结合的方法，分析了纯化的在鸡胚内增殖的流感病毒颗粒的蛋白组成谱，发现除了9种病毒编码蛋白外，还有12种鸡胚宿主编码的蛋白结合于病毒颗粒内。2实验局部2.1仪器与试剂乙腈和甲醇HPL级，Fisher公司；测序级胰蛋白酶Prega公司；抗烯醇化酶1和抗溶菌酶的单克隆

3、抗体Santaruz公司；BA蛋白检测试剂盒Piereheials公司；A型禽流感病毒H5N1AvianinfluenzavirusA/hiken/HngKng/YU22/2002，在III级生物平安实验室BL-3中进展培养。2.2病毒培养和离心纯化将A型禽流感病毒H5N1接种于鸡胚中，在35条件下孵育72h，搜集尿囊液；用0.03%福尔马林在4灭活72h；将含有病毒的尿囊液以5000r/in离心15in，搜集上清液。所有对活病毒进展的实验操作均在三级生物平安实验室完成。2.3SDS-凝胶电泳PAGE分析采用BA蛋白检测试剂盒对蛋白浓度进展测定。取含102.4质谱分析鉴定蛋白二级串联质谱分析完

4、毕后，所得数据用AnalystQS1.1软件DSSiex转换为GF格式文件，并使用AST搜索引擎在Siss-Prt数据库中进展蛋白检索。检索参数设置如下：1个漏切位点，母离子允许误差0.2Da，子离子允许误差0.1Da，固定修饰为半胱氨酸烷基化，可变修饰为甲硫氨酸氧化。2.5蛋白印记分析取含203结果与讨论3.1纯化流感病毒颗粒中病毒编码蛋白的鉴定Fig1SDSPAGEfinfluenzavirus本研究中，以20%60%/蔗糖密度梯度超速离心流感病毒，至少重复3次得到了高纯度病毒颗粒，确保后续的质谱分析中蛋白成分定性结果的可靠性。表1流感病毒编码蛋白的鉴定Table1Identifiatin

5、finfluenzavirus-endedprtEins蛋白名称Prteinidentity登录号Aessinnuberast分值astsre匹配肽段数/序列覆盖率Nuberfathedpeptides/PB1Q6DNX2877/119.26/86.41PB2Q6DNL810910/169.44/85.83PAQ6DNX6838/135.39/82.43HAQ6DQ182218/256.15/63.21NPQ6DPE545413/699.47/56.33NAQ6DPJ8792/96.07/48.951Q6DPT437812/849.24/27.932Q6DPT5581/124.88/11.24

6、NEPQ6DP63671/75.20/14.38Fig2S/Sspetrufapeakith/z469.2,hihisidentifiedasatryptipeptide*VLASTTAKfr1prteinfinfluenzavirusA型流感病毒基因组包含11个基因，编码11种蛋白，包括HA,NA,NP,1,2,NS1,NEP,PA,PB1,PB1-F2和PB2。本研究确定了除NS1和PB1-F2外的9种蛋白在成熟流感病毒颗粒中的表达。值得注意的是，一些病毒蛋白在多个凝胶小块中被鉴定出来，尤其是NP和1。对于离子通道蛋白2和核输出蛋白NEP，仅鉴定出单一的肽段，可能是由于其在病毒颗粒中的含量

7、明显低于其它构造蛋白，如HA和NA10。3.2纯化流感病毒颗粒包装宿主蛋白的鉴定图3a/z877.4的分子离子峰的串联质谱图；b/z398.3的分子离子峰的串联质谱图Fig3aS/Sspetruf/z877.4peak；bS/Sspetrufith/z398.3peak经数据库检索，该谱峰被鉴定为鸡胚宿主中溶菌酶的胰酶水解片段NTDGSTDYGILQINSR64-79，共含有16个氨基酸残基。从图3a可见，多数y系列碎片离子y1y13都能得到归属。图3b为另一个带双电荷的分子离子峰/z398.3的串联质谱图，经数据库检索，该谱峰被鉴定为鸡胚宿主中肌动蛋白的胰酶水解片段IIAPPER330-33

8、6。该片段含有7个氨基酸残基，全系列的y碎片离子y1y7都很容易得到归属。3.3蛋白印迹分析为了对质谱鉴定的结果进展验证，分别用抗烯醇化酶1和抗溶菌酶的单克隆抗体对相应的质谱鉴定结果进展蛋白印记分析。结果说明，本研究纯化的流感病毒颗粒中确实含有烯醇化酶1图4a和溶菌酶图4b，进一步证实了质谱分析结果。3.4小结本研究利用超速密度梯度离心的方法，纯化了繁殖于鸡胚的流感病毒颗粒；并采用质谱法，分析了流感病毒颗粒的蛋白表达谱，除了9种病毒编码蛋白外，还鉴定了12种鸡胚宿主编码的蛋白。本研究表2纯化病毒颗粒中宿主蛋白的鉴定Table2Identifiatinfhstprteinspakagedinpu

9、rifiedviruspartiles登录号Aessinnuber蛋白名称Prteinidentityast分值astsre匹配肽段数/序列覆盖率Nuberfathedpeptides/Sequeneverage%等电点/理论分子量pI/TheretialP17785膜联蛋白A2AnnexinA2934/126.92/38.64P51913烯醇化酶1Enlase11337/306.17/47.31P53478肌动蛋白,细胞质5型Atin,ytplasitype51025/235.30/41.84P00698溶菌酶Lyszye2218/389.36/16.24P24367肽酰-脯氨酰-顺反式异构

10、酶BPeptidyl-prlylis-transiseraseB926/339.40/22.41P24479S100钙结合蛋白A11S100aliu-bindingprteinA11764/376.08/11.41P51903磷酸甘油酸激酶Phsphglyeratekinase1397/238.31/44.72P0G62多聚泛素-BPlyubiquitin-B832/426.94/34.37P0B50过氧化物氧化复原酶-1Perxiredxin-11314/428.24/22.31P003553-磷酸甘油醛脱氢酶Glyeraldehyde-3-phsphatedehydrgenase1155/248.51/35.84P00548丙酮酸激酶肌同工酶Pyruvatekinaseusleisenzye1295/117.29/58.01P09206微管蛋白b-3Tubulinb-31235/154.78/4