11固相膜免疫测定

1、第十二第十二章固相膜免疫分析技术 标记免疫测定放射免疫测定 1960酶免疫测定 1970荧光免疫测定 19801990化学发光免疫测定 1990固相膜免疫测定 1990固相膜免疫测定的特点优点不足之处简便，快速敏感度略低，价格略高（与ELISA比）单份测定精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验）不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志心肌标志滥用药物固相膜的特点多孔性 毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性易于漂洗 操作简便常用的固相膜玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀( p

2、olyvinylidene fluoride ，PVDF)膜硝酸纤维素nitrocellulose，NC膜第一节胶体金免疫技术 胶体金免疫技术是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用抗原抗体反响的一种标记免疫测定技术。一、胶体金与免疫金的制备 胶体金：向一定浓度的金溶液内参加一定量的复原剂使金离子复原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶gold solution。 胶体金colloidal gold的制备一般采用复原法，常用的复原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。 胶体金的制备及特性胶体金粒径1%柠檬酸钠加入量胶体金特性（nm) （ml)*呈色波长max(nm）162.00 橙色5

3、1824.51.50 橙红色522411.00 红色52571.50.70 紫色535*复原100ml 0.01%HAuCl4 所需量胶 体 金Colloidal Gold1560 nm优 质劣 质 免疫金immunogold是指胶体金与抗原或抗体等大分子物质的结合物。 其制备过程实质上是抗体蛋白等大分子被吸附到胶体金颗粒外表的包被过程。胶体金结合物Conjugate二、胶体金免疫技术的方法学种类与原理斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)免疫层析试验immunochromatography assay, ICA斑点ELISA (do

4、t enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 一、斑点金免疫渗滤测定膜吸水垫料闭孔膜盖IFA双抗体夹心法测抗原AB二、斑点金免疫层析测定 DICA 斑点金免疫层析试验是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。 本法除层析条装置外，不需任何仪器设备。 IC

5、A 试剂条样品垫结合物垫NC膜吸水垫 ICA双抗体夹心法测抗原ICA间接法测抗体ICA 结果观察 阳性阴性无效IFA与ICA的比较IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试剂条试剂保存48 6个月室温一年操作步骤351观察时间3 min320 min阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变颜色逐渐加深IFA 穿流FLOW THROUGHICA 横流LATERAL FLOW第二节其他膜载体免疫分析技术一、斑点酶免疫吸附试验 Dot-ELISA二、免疫印迹法Westernblot法原理Westernblot抗原表位可能被破坏而漏检小 结 固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，