芍药甙对大鼠海马神经元的保护作用

1、芍药甙对大鼠海马神经元的保护作用【关键词】芍药甙；缺氧；海马神经元；抗氧化剂Neurprtetiveeffetfpaeniflrinnanxiallyulturedrathippapalneurns【Abstrat】AI:Tinvestigatehetherpaeniflrinhastheneurprtetiveeffetnanxiallyulturedrathippapalneurns.ETHDS:Hippapalneurnseretakenandgrnfr1014d,thendividedrandlyint4grupsardingtdifferentultureediusaddedith5

2、l/Lnidipine,40r80l/Lpaeniflrin,rnanyediine(asntrlgrup).Auteanxiadelasinduedith950L/LN2+50L/L2ixturegases.Theviableellsereuntedbytrypanblueethd.Theapptsisrateanddeathratefhippapalneurnsastestedbyflytetry(F).ThententsfDAandNandtheativitiesfSDinthesupernatantsfellultureeredeterinedbybiheialethds.RESULT

3、S:Inparisniththentrlgrup,paeniflrinsignifiantlyinreasedtheativitiesfSDanddereasedthententsfDAandNintheulturesupernatants(P0.01)anddereasedtheapptsisratefhippapalneurns,hihshedadseeffetrelatinship.NLUSIN:Thepaeniflrinhastheneurprtetiveeffetnhippapalneurnsagainstanxiinjury.Theehanisunderlyingthiseffet

4、fpaeniflrinaybeediatedbyeliinatingthefreeradials,byinreasingtheativitiesfantixidativeenzyestinhibitthexidativedaagesausedbyanxia.【Keyrds】paeniflrin;anxia;hippapalneurns;antixidants【摘要】目的：观察缺氧对大鼠海马神经元的影响及芍药甙的保护作用.方法：采用细胞培养方法获取1014d的海马神经元,将药物参加到培养液中，4h后建立950L/LN2+50L/L2混合气体急性缺氧模型,台盼蓝染色细胞计数并做流式细胞仪检测,以及

5、酶法测定抗氧化酶超氧化物岐化酶SD的抗氧化才能及丙二醛DA，N的含量.结果：离体条件下芍药甙组较对照组SD活性升高,DA及N含量降低P0.01，且成量效比例关系,同时细胞凋亡率显著降低.结论：芍药甙在体外有抗缺氧损伤的作用,其作用机制可能是通过抑制细胞凋亡,进步抗氧化酶的活力,去除自由基而发挥作用.【关键词】芍药甙；缺氧；海马神经元；抗氧化剂0引言脑缺血时机体产生大量的氧自由基,且N在体内部分浓度升高,与周围的氧自由基等反响而生成活性氮氧化合物,是一种强氧化剂,也可启动脂质过氧化.自由基医学的研究说明,神经元的损伤、凋亡、坏死等与脂质过氧化亲密相关,而抗氧化剂可通过去除自由基,进步抗氧化酶等途

6、径有效地阻断或防止这一过程1.芍药甙是芍药的主要成分之一,可以抑制花生四烯酸的代谢,具有抗血栓的作用,以及抗氧化和抗惊厥作用2.但对其在神经细胞中的作用及机制研究甚少.本试验通过体外培养海马神经元,建立急性气体缺氧模型,用台盼蓝染色细胞计数,流式细胞仪检测以及酶法测定抗氧化酶超氧化物岐化酶的抗氧化才能及丙二醛(AD),一氧化氮(N)的含量,讨论芍药甙是否有抗缺氧损伤的作用,以寻求预防和治疗脑缺血的药物.1材料和方法1.1材料新生13dister大鼠,雄性,32只,第四军医大学实验动物中心提供.芍药甙(中国医学科学院药物所);尼莫地平(德国拜耳公司);DE,马血清(Gib公司);胎牛血清(杭州四

7、季青生物材料工程公司);超氧化物歧化酶(SD),AD,N(南京建成生物工程研究所);多聚赖氨酸(Siga公司).2细胞培养箱(上海福玛实验设备),垂直单向流型YJ超净工作台苏州市干净技术研究所.1.2方法1.2.1海马神经元的培养和分组按已有的细胞培养方法3,取大鼠消毒,断头,别离出双侧海马,剪碎成13的组织块,参加1.25g/L胰酶消化30in,用含有100L/L胎牛血清及100L/L马血清的种植培养液终止胰酶的作用.制成细胞悬液1109/L接种到6孔板中(2L/孔),置于3750L/L2培养箱中培养24h,更换维持培养液50L/L胎牛血清,100L/L马血清,以后每3d半量换液1次,第45

8、日参加阿糖胞苷,终浓度为5g/L(25L/皿).接种1014d的海马神经元随机分为4组,即对照组,尼莫地平5L/L组,芍药甙40L/L组,芍药甙80L/L组.每组4个6孔板：将所用药物参加到细胞培养液中进展孵育.1.2.2尼氏染色鉴定神经元将培养的海马神经元经0.02l/LPBS(pH7.4)漂洗12次,40g/L多聚甲醛溶液固定1h,PBS漂洗后,10g/L甲苯胺蓝染液染色20in,950L/L乙醇分色,37枯燥,二甲苯透明,中性树脂封片.1.2.3缺氧模型的制备44h后将已分组给药的培养板移入37恒温密闭容器中,连续充以950L/LN2+50L/L2混合气体,流速为20L/in,持续1h.

9、1.2.4海马神经元细胞凋亡率的检测将上述处理过的细胞制成单细胞悬液,1000r/in离心10in,去上清,PBS冲洗,700L/L乙醇固定,400目的筛网过滤,加PI染液,上流式细胞仪检测.1.2.5海马神经元上清液中SD,DA和N的测定按试剂盒说明书的要求先求出样本的最正确加样量,海马神经元经上述同样处理后,取细胞上清液,按试剂盒说明书的要求操作,测定各样本的吸光度,并依以下公式计算出SD,DA和N的含量.SD活力(U/L)=(对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度/50%反映体系的稀释倍数样本测试前的稀释倍数DA含量(l/L)=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准

10、空白管吸光度)标准品浓度(10l/L)样本测试前稀释倍数N含量(l/L)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)标准品浓度(100l/L)样品测试前稀释倍数统计学处理：实验数据用xs表示,用简明统计(s2000)软件对实验结果先进展正态分布,方差齐性检验,假设方差不齐,那么进展F检验;假设方差齐,那么进展F检验.2结果2.1海马神经元的存活率别离出的海马细胞在接种之前,制备1109/L细胞悬液,用2L/L的台盼蓝染色,计数着色细胞和未着色细胞数,活细胞数为97%.光学显微镜下可见海马神经元胞质淡蓝色,尼氏体及核仁明显呈深蓝色.2.2海马神经元SD活性及DA,N的含量对照

11、组SD含量最低(P0.01),DA及N含量那么明显最高(P0.01);尼莫地平及芍药甙低、高剂量组SD活性依次升高,DA及N的含量那么依次降低(表1).表1各组海马细胞抗氧化酶活性及DA,N的含量(略)aP0.05vs对照,bP0.01vs尼莫地平.DA:丙二醛.2.3海马神经元凋亡率流式细胞仪测定PI荧光强度,分析各组细胞的凋亡率,对照组细胞凋亡率明显高于其他各组.对照组海马细胞凋亡率为3.07%,尼莫地平组为0.49%,40l/L和80l/L芍药甙组分别为0.44%,0.28%.3讨论脑缺血或脑缺氧的研究中,人们发现海马是脑内对缺血、缺氧最为敏感的部位之一.我们采用新生大鼠海马神经细胞培养

12、模型,该模型可直接研究药物对神经细胞缺氧损伤的机制.通过参加阿糖胞苷,可有效地抑制胶质细胞的生长,保证神经元的纯度5.本试验别离的细胞经台盼蓝染色检查,成活率达95%以上.尼氏体(Nisslbdies)常被称为嗜色小体或虎斑,主要成分由RNA和蛋白质组成.由于含有RNA,易被某些碱性苯胺染料所染色,如甲苯胺蓝.由此用来证明所培养的细胞中神经元占90%以上,可以认为是相对纯的神经细胞培养6.脑缺血是临床上常见的一种疾病,细胞凋亡无论是在短暂性脑缺血,还是在永久性脑缺血中均是神经细胞死亡的主要形式7-8.本实验采用PI单染法,通过流式细胞仪检测发现,对照组细胞凋亡率较其余3组升高.说明缺氧可以引起

13、细胞凋亡,而芍药甙可以抑制这种缺氧所引起的凋亡.正常情况下体内产生少量自由基属生理范围,可被抗氧化防御系统去除,使自由基的产生及去除处于动态平衡状态.当急性缺氧时,此平衡状态被打破,自由基积蓄从而造成脑损伤.其中DA含量的上下就可以反映机体内脂质过氧化的程度和细胞损伤的程度.试验中,对照组的含量最高,给药组那么依次降低P0.01,说明缺氧损伤了细胞,这与文献9报道一致,而芍药甙有抗缺氧损伤的作用.机体的防御系统中主要有SD,其活力上下间接反映了机体去除氧自由基的才能,常与DA相配对作为检测机体氧化程度的指标.试验中,对照组中SD明显降低,其余3组那么依次升高P0.01,说明缺氧抑制了SD的活性

14、.这与DA的结果相一致,说明芍药甙可通过抑制脂质过氧化发挥抗缺氧损伤的作用.N在脑缺血损害中所起的作用,一直是研究的重点.近来研究发现,在脑缺血损伤过程中神经细胞中的N合酶NS过度表达,可催化产生N,有超氧阴离子自由基(2-)存在时,迅速与其反响生成氧化毒性更强的过氧亚硝基(N2-)引起脂质过氧化反响,在损伤早期起关键作用10.本实验说明,芍药甙组的N含量明显低于其他各组P0.01,这说明缺氧损伤细胞造成N升高,而芍药甙可明显抑制其含量从而来保护细胞免受缺氧损伤.【参考文献】1王平,顾振纶,周文轩,等.心脑通胶囊对实验性脑缺血的保护作用J.中成药,2000,22(9):636.2RyuG,Pa

15、rkEK,JJH,etal.Aneantixidantnterpeneglyside,alphabenzylxypaeniflrinfrPaeniasuffrutisaJ.ArhPharRes,2001,24(2):105-108.3谈冶雄,李万亥,陶学斌.一种缺氧条件下的神经元培养方法J.第二军医大学学报,1997,18(2):181-183.4gaaN.FreeradialsandneuralelldaageJ.RinshShinkEigaku,1994,34(12):1266-1268.5申军现，金卫林，鞠躬.低密度体外培养大鼠海马神经元的形态学观察J.第四军医大学学报,2022,24(

16、6):489-491.6angFZ,DingAS,LiuZ.Effetfginsensides,againstanxidaagefhippapalneurnsinultureJ.AtaPharalSinia,1995,16(5):419-422.7urakaiK,NivzheH,angT,etal.AdvanesinapptsisresearhJ.BrainRes,1997,751:160-165.8NitatriT,SatN,aguriS,etal.DelayedneurnaldeathintheA1pyraidalelllayerfthegerbilhippapusfllingtransientisheiaisapptsisJ.JNeurs