DNA重组实验原理及步骤

1、实验十 DNA重组 一、实验原理 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5端磷酸和3端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分3步：首先，ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶ATP复合物。被激活的

2、AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5端的磷酸基团上，形成磷酸磷酸键。DNA链3端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应。二、仪器及试剂：1. 仪器：台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等。2. 试剂：T4 DNA连接酶、10T4 DNA连接酶缓冲液、 载体DNA、外源DNA。三、操作步骤1. 外源DNA片段和载体DNA的连接取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。10T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul酶切

3、后的DNA片段 *1 约0.3 pmol酶切后的载体DNA *2 约0.03pmolT4 DNA Ligase 1ulddH2O 加至 25ul*1 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的310倍。*2 相同末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。2.盖好盖子，用手指轻弹Ep管数次，并于台式离心机离心2s 以集中溶液。3.将反应管放入16过夜反应（1216h）。4.取出约25ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定连接结果，以未经连接的质粒DNA片段和酶切DNA片段作电泳。5.用0.1TE将连接混合物稀释至50ul，使用1020ul转化大肠杆菌

4、感受态细胞。四、注意事项1. 连接产物经鉴定后应迅速做转化实验。2. 根据具体情况调节酶的用量。平端连接或接头连接都比黏端连接慢得多，而且酶的用量也增大。3. 单价阳离子或低浓度的聚乙二醇可提高平端连接的效率。4. 防止载体DNA自身环化，常用碱性磷酸酶处理线性载体，去掉载体的5?C磷酸以抑制DNA片段的自身环化。5. 正确调整载体DNA和外源DNA之间的比例有助于获得高产量的重组产物。五、相关问题1. 连接反应的影响因素除了载体、供体的浓度及其比例等因素外，影响连接反应的因素还有很多，如缓冲液组分、连接温度与时间、酶浓度、DNA浓度及片段末端的碱基序列等。（1）连接缓冲液的影响不同的公司提供

5、的连接缓冲液可能有所不同，但大体上都含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。（2）pH的影响一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。有

6、实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。（3）ATP浓度的影响连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于-20保存，

7、溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。（4）连接温度与时间的影响因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20 30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20 60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考

8、虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。（5）酶浓度的影响根据New England Biolabs公司对T4 DNA连接酶的定义，1U的酶可在16 30min内连接20ul体系中Hind 酶切片段（黏性末端为0.12umol/L 5,末端，此时DNA质量浓度约为300ng/ul）的50%。日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍，厂商为了满足这一要求，又往往提供高浓度的酶（几百个单位/ul），所以进行黏末端连接时需先行稀释。除了立即用于反应的部分可用酶反应缓冲液稀释外，其余都应使用厂商提供的稀释液。稀释液的成分与酶保存

9、缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。（6）DNA浓度的影响尽管有的实验手册上推荐使用0.1-1nmol/L的DNA浓度，但考虑到用质粒作为载体克隆时，最后要求得到环化的有效连接产物，所以DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。相比较而言，以噬菌体、cosmid质粒为载体的克隆过程最后要求线性化的连接产物，所以，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。此外，在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，

10、所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。2. 三种连接酶单位定义（1）Weiss单位连接酶单位最早是1968年由Weiss提出的Weiss单位，现也称PPi单位。他的单位定义为：37 20min内将1nmol的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上所需的酶量。现在大多数厂商仍使用这种单位。（2）d（A-T）环化单位由于Weiss单位定义中测试的是T4 DNA连接酶中除连接功能外的另一种磷交换功能，并且测试温度高达30，与实际连接反应相比无论在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich与Lehman提出了真正度量连接功能的d(A-T)环化单位，又称外切酶抗性检测。d（A-T）环化单位的定义为：30 30min 内将100nmol/L的d（A-T）（约2kb长）转化成抗外切酶的形式。（3）黏性末端单位与Weiss单位相比，d（A-T）环化单位更接近实际，但仍有一定的问题，例如，环化单位测试中用的是纯AT片段，与实际连接中4种碱基随机排列不符；再说，如果连