高效液相色谱与气相色谱在中药检验中的应用

1、高效液相色谱与气相色谱在中药检验中的应用主要内容高效液相色谱法气相色谱法高效液相色谱法一. 高效液相色谱法概述二. 高效液相色谱法中的一些相关术语三. 范第姆特方程及其在高效液相色谱中的应用四. 高效液相色谱仪的简介五. 高效液相色谱仪的使用与保养六. 高效液相色谱仪常见故障分析七、举例八. 高效液相色谱仪的检定高效液相色谱法特点一、高效液相色谱法的概述1、.高效液相色谱法的特点2、高效液相色谱法的分类3、高效液相色谱法的影响因素4、高效液相色谱法的应用5、超高效液相色谱（UPLC）高效液相色谱法特点1.高效液相色谱法的特点1.1原理：利用混合物中各组分在不同的两相中溶解，分配，吸附等作用性能

2、的差异，当两相做相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。 相：在某一系统中，具有相同成分及相同物理和化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面。 高效液相色谱法特点 1.2高效液相色谱法 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）是在六十年代末，以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱法的理论与试验方法，流动相改为高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号

3、。 高效液相色谱法特点 适用范围广分离效率高（理论板数达两万，分离上百个成分）速度快流动相可选择范围宽灵敏度高（高灵敏度的检测器）色谱柱可反复使用流出组分容易收集（样品回收容易，且定量）安全高效液相色谱法分类 2. 高效液相色谱法的分类以固定相的聚集状态分： 液液色谱 液固色谱以分离机制分：分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 分子排阻色谱高效液相色谱法分类 类型 固定相 流动相 出峰顺序正相色谱极性填料（氰基与氨基化学键合相 ）非极性或弱极性溶剂极性小的先流出反相色谱非极性填料（十八烷基硅烷键合相 ）极性或中等极性溶剂极性大的先流出高效液相色谱法分类将离子对试剂加入极性流动相中，被分析的离子在流

4、动相中与离子对试剂生成不带电的中性离子对，从而增加了在非极性固定相中的溶解度，从而改善分离效果。 解度，从而改善分离效果。 反向离子对色谱高效液相色谱法分类解度，通过调节流动相的pH值，抑制组分解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的。 可用于分析3 pKa 7弱酸和7 pKa 8弱碱 注意：pH值应控制在2 8。 从而改善分离效果。 离子抑制色谱 高效液相色谱法影响因素 载体的形状、粒径、孔径、表面积、鍵合基团的表面覆盖度、含碳量、键合类型等以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm 以下的填料，分析分子量大

5、于2000的化合物应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外，普通分析柱的填充柱的粒径一般在310m之间，粒径更小（约2m）的填充剂常用于填装微径柱（内经约2mm)填充剂的性能 高效液相色谱法影响因素 以硅胶为载体的鍵合固定相的使用温度通常不超过40 ，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60 柱温高效液相色谱法影响因素 pH值应控制在28。 当pH值大于8时，可使载体硅胶 溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学鍵合相易水解脱落。 当色谱系统中使用pH值大于8时的流动相时，应选用耐碱的填充剂 当色谱系统中使用pH值小于2时的流动相时，应选用耐碱的填充剂流动相高效液相色谱法影

6、响因素 反相色谱系统的流动相首选甲醇水系统（采用紫外末端波长检测时，首选乙腈水系统），如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。 流动相的选择高效液相色谱法影响因素各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等

7、，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50）相对于自身的改变量不超过30且相对于总量的改变量不超过10为限，如30相对改变量的数值超过总量的10时，则改变量以总量的10为限。对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种项下注明 高效液相色谱法应用 定性分析 定量分析 高效液相色谱法应用定性分析色谱鉴定法：利用保留时间相互对照，进行定性分析化学鉴定法：收集各组分流出液，用官能团鉴定试剂进行定性分析两谱连用：液质联用高效液相色谱法应用定量分析外标法 标准曲线法 外标一点法内标法 标准曲线法 内标一点法 校正因

8、子法面积归一化法UPLC 超高效液相色谱超高速度 超高灵敏度 超高分离度 利用高效创新小颗粒 填料（1.7L），获得超强分离能力，更高的柱效和更窄的色谱峰，意味着更高的色谱峰高和更高的灵敏度 在得到超高分离度和超高速度的同时能够得到超高灵敏度 高效液相色谱相关术语二、高效液相色谱中的一些相关术语色谱峰与基线 色谱仪以电信号强度对时间做图所绘制的曲线，即色谱图。曲线突出的部分即色谱峰，水平部分即基线。 峰高（h） 色谱峰最高点到峰底的垂直距离。 峰宽（W） 峰两侧拐点处所作的两条切线与基线的两个交点间的距离。半高峰宽（W1/2） 峰高度一半处的峰宽。峰面积（A） 峰曲线与峰底（基线）所包围的面积

9、。 高效液相色谱相关术语死时间（t0） 不保留组分从进样开始到流出色谱柱所需的时间，即流动相通过色谱柱的间。死体积（V0） 柱中溶剂的总体积，即流动相的体积。保留时间（tR）样品通过色谱柱所需的时间，即从进样开始到柱后出现的组分浓度最大值，所需的时间。保留体积（VR）从进样开始到柱后出现的组分浓度最大值时流出溶剂的总体积。调整保留时间（tR） 扣除了死时间的保留时间。调整保留体积（VR） 扣除了死体积的保留体积。高效液相色谱相关术语色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中，分离度和重复性尤为重要。按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶

10、液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。色谱系统的适用性试验高效液相色谱相关术语理论塔板数（N）理论塔板数N 表示：组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数。用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论板数。N是色谱柱的分离效率的定量表达方式，当色谱峰为对称并符合高斯分布，理论板数可近似的表达为: 5.54（Wh/2）2高效液相色谱相关术语分离度（R）用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键

11、指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与控制。无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。高效液相色谱相关术语分离度（R）分离度（R）指相邻两峰的分离程度。简单的说分离度就是两峰相对于其峰宽分开得有多远。定量分析时分离度应不小于1.5。R 高效液相色谱相关术语重复性对照品溶液连续进样5次，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。高效液相色谱相关术语拖尾因子（

12、T）用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。峰高法定量时，拖尾因子T 应0.951.05之间。峰面积法测定时，若拖尾严重，将影响峰面积的准确测量。必要时，应在各品种项下对拖尾因子作出规定。高效液相色谱相关术语测定法 内标法：各品种项下的规定，精密称（量）取对照品内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取定量注人仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：校正因子（f)AS/CS CR/AR再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内

13、标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：含量=f AX/AS/CS采用内标法,可避免因样品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。高效液相色谱相关术语测定法外标法：含量=CRAX/AR各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注人仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：高效液相色谱范第姆特方程 当色谱柱长L固定时，理论塔板高度值H越小，理论塔板数N越高，柱效率越高，分离能力越强。三、范第姆特（Van Deemter） 方程 1956年荷兰学者范第姆特（Van Deemter）等人在研究气相色谱时，提出了色谱过程动

14、力学理论，他们吸收塔板高度的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合进去，指出理论塔板高度H是峰宽的量度，导出了塔板高度H与线速度的关系式： 高效液相色谱范第姆特方程 H：理论塔板高度，是指为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长。 A：涡流扩散项（与固定相颗粒大小、几何形状及装填紧密程度有关） B/u：分子扩散项（很小，一般可以忽略不计） Cu：传质阻力项，它与流动相的粘度和柱温有关 高效液相色谱范第姆特方程 理论塔板高度H与理论塔板数N的关系：N=L/H当色谱柱长L固定时，理论塔板高度值H越小，理论塔板数N越高，柱效率越高，分离能力越强。 当色谱柱长L固定时，理论塔板高度值H越小，理

15、论塔板数N越高，柱效率越高，分离能力越强。高效液相色谱范第姆特方程 1、减小填料颗粒粒度2、用粘度低的溶剂作流动相3、采用低流速流动相4、适当提高柱温 当色谱柱长L固定时，理论塔板高度值H越小，理论塔板数N越高，柱效率越高，分离能力越强。由范第姆特方程，我们可以推出，为了提高柱效，我们可以采用以下方法:高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪的简介一台高效液相色谱仪一般由输液泵，进样器，色谱柱，检测器，记录仪等几个部分组成。高效液相色谱仪简介 输液泵是用来输送流动相的。 色谱仪对泵的要求：无脉动，流量恒定 耐高压，耐腐蚀 1、输液泵 高效液相色谱仪简介 2、进样器 隔膜进样器只能在低压或停流状态下进

16、样，易漏液六通进样阀进样量准确，重复性好自动进样器进样量准确，可按要求改变进样量高效液相色谱仪简介常用的反相色谱柱是以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八，碳八，胺基等基团联在基质上，为固定相。 优点： 固定相稳定，不易流失，机械性能好 应用广泛，可使用多种溶剂 缺点： pH值不能小于2（键合相水解），也不能大于8（硅胶溶解） 同样填料，各种品牌色谱柱不尽相同 3、色谱柱 高效液相色谱仪简介 检测器是色谱仪的“眼睛”专用型紫外检测器 荧光检测器 电化学检测器 通用型示差折光检测器 蒸发光散射检测器4 、检测器高效液相色谱仪简介最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，二极管阵列检测器可

17、以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。其他常见的检测器有荧光检测器（只能检测能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质）。（在分析氨基酸时，采用柱前衍生法制备衍生物，使用荧光检测器检测） 电化学检测器（利用组分的氧化还原反应产生的电流或电压的变化进行检测，（灵敏度很高，但对于不能氧化还原的物质，不适用）质谱检测器蒸发光散射检测器示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。高效液相色谱仪简介选择性检测器

18、：紫外、荧光、电化学检测器为，其响应值不仅与供试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；通用型的检测器：蒸发光散射检测器和示差折光检测器，是利用组分与流动相的折射率之差进行检测的（只对少数类别的物质的检测灵敏度高）对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品的质量有关。高效液相色谱仪简介 紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时，般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止

19、使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。高效液相色谱仪使用与保养 五.高效液相色谱仪的使用与保养1.使用前的准备：流动相的准备 样品溶液的准备2.使用与保养：输液泵的使用与保养 检测器的使用与保养 色谱柱的使用与保养高效液相色谱仪使用与保养 色谱柱对流动相的要求： 过滤除去杂质 纯度的要求 缓冲液pH值在填料允许的范围（一般28）内 缓冲盐浓度不要太高 流动相对样品的溶解度1.1流动相的准备高效液相色谱仪使用与保养 1.2 流动相脱气的目的 1.2 流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确 提高色谱峰的保留时间和峰面积的重现性提高检测器的性

20、能 消除因流动相中含有气泡而产生的尖峰 基线稳定，信噪比增加 保护色谱柱 防止色谱柱中填料被氧化 高效液相色谱仪使用与保养 加热操作较复杂，易使流动相的组成变化抽真空溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声简单，效果较差，时间不宜过长通惰性气体一般用氦气，效果好，成本高在线脱气机在线连续脱气 平时试验中流动相一般是先抽滤，再超声脱气，然后使用 ，既方便，也基本能满足检验要求。1.2 流动相脱气的目的流动相脱气的方法高效液相色谱仪使用与保养 1.4 流动相的保存1.4流动相的保存有机流动相的保存溶剂流动相 室温下密封，避光保存含缓冲盐流动相 现配现用 低温下密封保存，一般不超过3天 防止有机相挥发，防

21、止微生物生长选用适宜的容器 塑料容器对超声波有吸收作用 一般保存在棕色玻璃瓶中高效液相色谱仪使用与保养 1.4 流动相的保存1.5流动相的平衡一般平衡0.51小时就可以稳定工作含离子对试剂的流动相平衡的时间相对 要长一些。高效液相色谱仪使用与保养 1.4 流动相的保存2样品溶液的制备样品预处理的目的： 除去微粒 减少干扰杂质 提高检测器的灵敏度和选择性 改善分离的效果 有利于保护色谱柱及仪器高效液相色谱仪使用与保养 1.4 流动相的保存2.1样品溶液常用的处理方法过滤，高速离心10000rpm超滤基于分子量的分离技术选择性沉淀生化样品中除蛋白衍生反应提高检测的灵敏度液液萃取富集微量组分固相提取

22、高效液相色谱仪使用与保养 1.4 流动相的保存3输液泵的维护保养流动相要过滤常用缓冲盐时，停泵前要用水清洗泵头关闭排液阀时，不要太用力拧，以不渗液为准更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性色谱泵停用时，应先用水洗去缓冲盐，然后用纯甲醇充满泵头和管路，并保存在纯甲醇中高效液相色谱仪使用与保养 1.4 流动相的保存4、检测器的使用和保养如果长时间不用检测器可以关掉光源灯 仅在4小时以上不用时，才需关灯 频繁开关灯也会影响灯寿命不要让缓冲盐长期停滞在检测池内 用纯水冲洗 保存在纯甲醇中高效液相色谱仪使用与保养 1.4 流动相的保存5、色谱柱的使用和保养1.拿到一根新的色谱柱的时要仔细阅读说明书（用甲醇

23、活化，冲12个小时）2.使用保护柱（多数保护柱都会影响到整个色谱柱的柱效，保 护柱应选用与所用色谱柱品牌和内径一致的）3.注意色谱柱的连接：方向4.注意色谱柱的存放高效液相色谱仪使用与保养 1.4 流动相的保存6、色谱柱的连接一般柱子接头为不锈钢卡套接头或PEEK（聚醚醚酮）工程塑料管线手拧接头。使用不锈钢卡套接头时，当完成第一次安装后，不锈钢卡套已固定死，当接不同的柱子时，要注意柱子接头处的形状和长度，否则会产生一个非常大的死体积 。样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积，都会使样品分子扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低 。 高效液相色谱仪使用与保养 1.4 流动相的保存不同品

24、牌色谱柱接头长度的比较高效液相色谱仪使用与保养 1.4 流动相的保存不同品牌色谱柱接头长度示意图高效液相色谱仪使用与保养 1.4 流动相的保存死体积对色谱峰的影响高效液相色谱仪使用与保养 接头接头长度不合适造成的渗漏高效液相色谱仪使用与保养 接头建议使用整体式PEEK工程塑料接头优点 PEEK管路容易连接；接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。缺点 PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好，遇到上述溶剂会变脆。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi的压力。压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死

25、体积或漏液。高效液相色谱仪使用与保养 接头7色谱柱的存放存放前的处理除去杂质和缓冲盐合适的存放溶剂一般存放在纯甲醇中避免色谱柱床的干涸两头要拧紧，隔3 4个月用甲醇适当冲洗避免机械振动轻拿轻放防止细菌生长注意存放的温度（凝胶柱不能存放在冰箱里）高效液相色谱常见故障分析 高效液相色谱常见故障的分析1.色谱峰问题2.系统压力问题3.基线噪音问题高效液相色谱常见故障分析 原则一：确认问题至少发生两次以上原则二：从最简单的因素入手 原则三：一次只变化一个因素原则四：恢复原状原则五：养成良好的记录判断故障的原则高效液相色谱常见故障分析 1. 色谱峰问题双峰或肩峰 进样量或样品浓度过大 保护柱或色谱柱进口

26、堵塞 柱头塌陷高效液相色谱常见故障分析 2、色谱峰问题前伸峰 进样量或样品浓度过大 溶解样品的溶剂相对于流动相太强 保护柱或色谱柱污染或失效高效液相色谱常见故障分析 色谱峰问题保留时间不稳定 系统不稳定或未达化学平衡泵压力不稳（泵头里有气泡）进样体积过大或样品浓度过大温度波动流动相混合不均匀系统渗漏高效液相色谱常见故障分析 系统压力问题压力高 流动相粘度大，流速高管路或色谱柱堵塞（减小死体积，管路细）压力传感器问题高效液相色谱常见故障分析 系统压力问题压力低或没有压力 泵未正确排气（泵头有气泡）溶剂入口过滤头堵入口管路中有空气系统有渗漏高效液相色谱常见故障分析 流路基线噪音问题 基线噪音大，基

27、线漂移：紫外灯光源能量不够流动相脱气不完全系统中有渗漏检测器未正确接地有迟流出的组分高效液相色谱举例 枳壳 基线噪音大，基线漂移：1、取样 取本品粗粉0.2g，关注点粗粉的要求：指全部通过二号筛，但混有能通过四号筛不超过40%的粉末。2、称量：供试品（平行样品）、对照品(天平的要求）3、供试品溶液的制备4、过滤，取续滤液（滤膜）5、液相进样前的准备：流动相的配制、排气、平衡流动相6、重复性试验：色谱相应值的重复性能，取柚皮苷对照品溶液，连续进样5次，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%，说明仪器性能良好，供试品每份样品进两针，取平均值。七、举例高效液相色谱举例 枳壳 新橙皮苷高效液相色

28、谱举例 枳壳 新橙皮苷高效液相色谱举例 计算 高效液相色谱举例 计算 高效液相色谱举例 计算 高效液相色谱举例 银杏叶片 萜类内酯的测定：蒸发光散射检测器高效液相色谱举例 银杏叶片 找原因：1、供试品前处理阶段萃取的过程中，上下两层一定要澄清，避免杂质干扰。2、调蒸发温度3、调流速4、微调流动相5、色谱柱本身的干扰六. 举例 银杏叶片 找原因：1、供试品前处理阶段萃取的过程中，上下两层一定要澄清，避免杂质干扰。2、调蒸发温度3、调流速4、微调流动相5、色谱柱本身的干扰本品流动相为正丙醇-四氢呋喃-水（1：15：84），由此可看出水相比较大，因此蒸发温度要在100110 之间才能保证完全雾化。因

29、此调节蒸发温度，得到下图。高效液相色谱举例 银杏叶片 高效液相色谱举例 复方丹参片：改变流动相的组成比例 高效液相色谱举例 复方丹参片：改变流动相的组成比例 流动相的组成比例为：高效液相色谱举例 制川乌、制草乌：改变流动相的组成比例 流动相：梯度洗脱高效液相色谱举例 制川乌、制草乌：改变流动相的组成比例 流动相：梯度洗脱在色谱峰分离达不到要求时也可调整比例高效液相色谱举例 对于色谱柱的要求 高效液相色谱举例 对于色谱柱的要求 高效液相色谱举例 进样量的影响 15l高效液相色谱举例 进样量的影响 进样量做好在10l左右5l高效液相色谱举例 色谱柱的影响 进样量做好在10l左右5l高效液相色谱举例 色谱柱的影响 5l色谱柱的活化 高效液相色谱仪检定 泵： 泵流量设定值误差Ss2% 泵流量稳定性误差SR2% 定性重复性RSD1.5% 定量重复性RSD1.5% 紫外检测器 基线噪声510-4AU 基线漂移510-3AU/h 最小检测量410-8g/ml（萘的甲醇溶液） 八、高效液相色谱仪的检定气相色谱-组成气相色谱-组成气相色谱载气气相色谱进样方式进样口部分GC进样方式气相色谱进样方式气相色谱进样方式气相色谱进样方式气相色谱进样方式气相色谱