愈创木酚比色法测定过氧化氢酶活性

1、过氧化物酶活性的测定（愈创木酚比色法）原理过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。721型分光光度计秒表研钵愈创木酚20mmol/L仪器药品离心机天平磁力搅拌器30%过氧化氢KH2PO4100mmol/L磷酸缓冲液，pH6.0（见附表2）反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）50ml于烧杯中，加入愈创木酚28pl,于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19pl,混合均匀，保存于冰箱中。操作步骤称取植物材料1g，加20mmol/LKH2PO45ml

2、，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心15分钟，倾出上清液保存在冷处，残渣再用5mlKH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液，贮于冷处备用。取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3ml，KH2PO41ml，作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量吸光度值，每隔1分钟读数一次，读数于波长470nm下进行。3.以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470/min*mg蛋白质（或鲜重g）表示实验三十八过氧化物酶活性的测定（比色法）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合

3、作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。一、仪器、药品与材料（一）实验材料新鲜植物组织。（二）仪器与用品分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100mL容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器。（三）试剂.愈创木酚。.30%过氧化氢。.100mmol/L磷酸缓冲液pH6.0（见附录7）。反应混合液：取100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0

4、）50mL于烧杯中，加入愈创木酚28卩L,于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19卩L，混合均匀，保存于冰箱中备用。二、实验步骤称取植物材料0.1g，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用mL磷酸缓冲液提取一次，以4000rpm低温离心15min，上清液即为粗酶液，定容至10mL刻度，贮于低温下备用。取2支试管，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之）。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470nm处测定吸光度（OD）值，每隔10S读数一次。结果计算：以每分钟0D变化值（4A470/gFWmin）表示酶活性大小，。也可以用每minOD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位(U)表示。过氧化物酶活性(U/gFWmin)=A470XVT/WXVSX0.01Xt式中：A470反应时间内OD变化值。VT提取酶液总体积(mL)。W植物鲜重(g)oVs测定时取用酶液体积(mL)ot反应时间(min)o三、思考题1测定过氧化物酶活性除了本方法外，还可以采用什么方法进行？2在植物体