无菌检查法基础培训

1、无菌检查法目 录一、定义与概述A二、环境B三、菌种C四、培养基D五、方法确认E六、日常无菌检查F一、定义与概述无菌物品： 指物品中不含任何活的微生物。一、定义与概述二、环境（一）实验环境1.环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行（或C级下的局部A级）。2.阳性实验室、微生物限度检查间、无菌检查间分离。3.严格按无菌操作,防止实验室的培养物被其他外来微生物污染；避免操作者自身被微生物感染。 4.无菌操作在有洁净级别的实验室中进行，与试验相关的金属器械、玻璃器皿、稀释剂等应经过灭菌处理；其他的材料应经过表面消毒、紫外线照射消毒后，再带入实验室 。实验器材灭菌器材消毒器材

2、凡是检验中使用的器材，能灭菌处理的，必须灭菌处理。如：玻璃器皿、吸管、培养基、稀释剂、无菌衣、口罩等，在使用前必须经过适当方法灭菌，并在较洁净的环境中保存备用。凡检验用器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理。如：无菌室的桌凳、天平、工作台以及工作人员的手等。6二、环境二、环境（二）无菌操作基本概念：无菌操作一般是指在无菌环境条件下，使用无菌制品或无 菌器材进行检验或实验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。操作目的：(1)保证检验物品不被环境中的微生物的污染； (2)防止被检微生物在操作中污染实验人员和实验环境。主要方面：(1)实验前的控制(2)检验过程的控制(3)意外事故的控

3、制二、环境（1）实验前的控制1、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；2、无菌室在使用前开启紫外线灯3060min进行空气消毒；3、在进行接种倾注琼脂平板均需在超净工作台或层流罩内操作；4、检查一切进入无菌环境的器材灭菌、消毒的标志物是否完备；5、洗手消毒：首先用肥皂涂在手上揉搓1015s，肥皂虽不杀菌，有去污作用，然后用流水彻底冲洗，可有效除去手上大多数暂住菌，如连续洗23次(视手的污染程度)，使残余的微生物减少到最低水平，再用消毒液洗手，如新洁尔灭、乙醇等。6、操作人员将手部消毒后，先戴无菌手套，再穿戴无菌工作服(包括鞋、帽、口罩等)。严格的无菌服应是戴帽套头的无扣的上衣，颈部、脸部及袖口是

4、紧口的，以保护身体，防止污染。一般的无菌衣是背开口，围胸部、紧扣颈部与长袖紧口的，以保护身体，防止污染。7、在进入无菌室后，进行检验或实验操作前应再次佩戴无菌手套，实验过程中应用浸有消毒液的棉球或泡沫塑料物消毒手。8、检查过程中应对环境沉降菌及手指表面微生物进行监测。二、环境（2）检验过程的控制1、在所有操作中均不应大幅度或快速动作，以免搅动空气中尘埃微粒。2、使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。3、在近火焰区操作。4、使用金属接种器具、用前、用后均需燃烧灭菌。5、用注射器吸取样品、培养物时，注射器内应无空气；装卸针头时应用灭菌的镊子；从密封容器内抽取液体时，应注入无菌空气；带液

5、体的针筒针头应向上倾斜，并用75%乙醇棉球(挤干)保护针头根部；注射时勿用力过猛，以免内容物喷出或针头脱落使溢出液体污染灭菌器材或环境。6、当灭菌瓶塞或试管塞掉落在工作台上，不宜再用，应另换无菌塞，或通过火焰处理后再用。二、环境（3）意外事故的控制1、当无菌衣受污染，应脱下翻转包裹，使污染部分包在内部，送往消毒，经灭菌后，洗涤再用。2、因偶然打破盛有培养物的器皿，致使病原性的菌种外溢，污染了工作室及操作者的衣物及体表时，首先应冷静，切勿乱动以免扩大污染面。应唤他人用浸透消毒液的毛巾或纱布覆盖于碎片上，或将消毒液倒在污染区，浸没一定时间。先从外至内逐步清理污染源，最后将衣物彻底灭菌。清理时应避免

6、用手指收集玻璃碎片，以防污染皮肤，造成病原性微生物感染事故。3、对一般小面积的污染可自行处理，较大范围的污染则请人协助。三、菌种三、菌种（一）菌种的保存保存的原则：根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以降低菌种的变异率。保存步骤：保存方法：选择典型菌落确定菌体形态选择保藏方法定期检查方法主要原理适用的微生物包藏时间特点琼脂斜面低温保藏法低温（4）广泛16个月简便液体石蜡保藏法低温，缺氧广泛1年以上简便干燥（砂土）保藏法干燥，无营养产孢微生物110年简便有效冷冻真空干燥法干燥，缺氧、低温广泛5

7、10年复杂但有效液氮超低温保藏法超低温广泛数十年复杂但有效（二）菌种的复苏及传代一般为冻干粉剂，安瓿瓶密封包装。增菌性培养选择性培养基分离菌种。斜面接种、培养保存13三、菌种注：菌株传代次数不得超过5次。三、菌种（三）斜面接种操作方法左手持分离培养的平板培养基，右手持接种环，经火焰烧灼，冷却后在平板上挑取菌落。左手立即放下平板，换持斜面培养基，用右手小指和无名指拔出管塞，夹持于手指之间。将管口在火焰上通过两三次，但勿烧烫。再迅速将挑取有菌的接种环伸进斜面内，从斜面的底部向上划一条接种线，又自下而上蜿蜒接种成曲线。退出接种环，塞上管塞。接种环经火焰灭菌后放置。培养后，沿接种线长出菌苔，非接种线的

8、部位应无细菌生长。三、菌种采用斜面保存的菌种三、菌种（四）菌液的制备四、培养基（一）实验过程所需的培养基及稀释液1.胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养2.硫乙醇酸盐流体培养基用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养3.胰酪大豆胨液体培养基用于细菌的计数4.沙氏葡萄糖琼脂培养基用于霉菌的技术5.0.1%无菌蛋白胨水溶液6.PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液7.0.9%无菌氯化钠溶液四、培养基（二）培养基配制 称量调PH分装包扎 灭菌用1N NaOH或1N HCl调pH。高压灭菌前培养基的pH可比最终pH值调高0.2左右，灭菌后基本合适。按照生产商提供或使用者验证的参数进行。用量筒或移液器进行分

9、装，注意不要污染硅胶塞。标签，注明何种培养基。四、培养基（三）培养基的贮存外购培养基 应严格按照供应商提供的贮存条件、 有效期和使用方法进行培养基和试剂的保 存和使用。制备好的培养基制备好的培养基应保存在225、避光的环境中，一般应在3周内使用；琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，一般不超过一周，且应密闭包装；固体培养基灭菌后只允许一次再融化，融化后的培养基应置于4550的环境中，不得超过8小时。四、培养基（四）培养基适用性检查无菌性检查排除培养基本身的污染，避免无菌试验过程中由培养基引起的假阳性。 灵敏度检查确保培养基营养性良好，对微生物具有生长促进作用，排除无菌试验过程中由培养基引起的假阴

10、性。注：用于无菌检查的培养基必须经过培养基适用性检查。四、培养基（四）培养基适用性检查培养基培养基装量检查项目菌株数量菌量培养硫乙醇酸盐流体培养基12ml灵敏度检查金葡2100cfu/ml30353天铜绿2生孢2阴性1/无菌性检查/5/303514天胰酪大豆胨液体培养基9ml灵敏度检查枯草2100cfu/ml20255天白念2黑曲霉2阴性1/无菌性检查/5/202514天四、培养基（四）培养基适用性检查无菌性检查结果判定 每批培养基随机取不少于5支（瓶）置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。 灵敏度检查结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规

11、定。五、方法确认目的：确认无菌试验的产品是否具有抑菌性；如果有，如何去除，并被证实。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可忽略不计。无菌检查采用的方法必须与适用性试验方法一致，确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。分类：直接接种法和薄膜过滤法。五、方法确认直接接种法方法确认培养基菌株菌量供试品组别培养硫乙醇酸盐流体培养基金葡100cfu/ml试验组3035不超过5天金葡阳性对照组大肠试验组大肠阳性对照组生孢试验组生孢阳性对照组胰酪大豆胨液体培养基枯草试验组2025不超过5天枯草阳性对照组白念试验组白念阳性对照组黑曲霉试验组黑曲霉阳性对照组五、方法确认薄膜

12、过滤法方法确认供试品稀释、过滤菌株菌量培养基组别培养金葡最后一次冲洗液加菌 100cfu/ml硫乙醇酸盐流体培养基试验组3035不超过5天金葡阳性对照组大肠试验组大肠阳性对照组生孢试验组生孢阳性对照组枯草胰酪大豆胨液体培养基试验组2025不超过5天枯草阳性对照组白念试验组白念阳性对照组黑曲霉试验组黑曲霉阳性对照组五、方法确认结果判断：与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检査方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌

13、作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。五、方法确认产品有抑菌性的措施：1.增加冲洗量2.增加培养基的量3.使用中和剂或灭菌剂4.更换滤膜品种注：消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验 日常进行无菌检查阳性对照菌的选择：无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主的供试品，选择金黄色葡萄球菌为对照菌。六、日常无菌检查常用实验设备及器具：1.电子天平用于培养基干粉的称量2.压力蒸汽灭菌器用于培养基及实验物品的灭菌3.恒温培养箱用于细菌的培养4.生化培养箱用于霉菌及酵母菌的培养5.超净工作台用于实验环境的提供6.生

14、物安全用于实验环境的提供7.其他实验材料移液器、量筒、剪刀、镊子、无尘布、试管、与试管配套的胶塞、培养皿等六、日常无菌检查注：检验量和培养基的装量都应与方法适用性试验方法一致。六、日常无菌检查准备间培养基、供试品、灭菌物品的准备无菌检查室供试品接入培养基FTM+供：N+1管TSB+供：N管阴性：FTM、TSB各1管阳性对照室取其中一支FTM+供加入小于100cfu金黄色葡萄球菌培养室FTM：3035TSB：2025培养14天，阳性培养72小时以内，逐日观察。结果判断阳性：生长良好阴性：无菌生长供：无菌生长无菌检查基本流程：六、日常无菌检查培养及观察：六、日常无菌检查结果判断：阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明