铜蓝蛋白生理功能及其和疾病的关系

1、铜蓝蛋白生理功能及其和疾病的关系 1 铜蓝蛋白的研究概况 铜蓝蛋白( EC 1. 16. 3. ) 又称铜氧化酶,是Holmberg 和 Laurell 于 1948 年首先从人血清 a2 -球蛋白中纯化出的一种外观呈蓝色的:请记住我站域名/ 2 铜蓝蛋白的结构 人的 Cp 基因位于 8 号染色体,基因定位3q23 - q25,基因长度为 65 kb,包含 19 个外显子。 人的 Cp 蛋白是一条单一的多肽链,由1046 个氨基酸和附着在上面的 4 个寡糖一氨基葡萄糖组成,相对分子质量约为 132 kDa4. 二级结构测定表明,Cp 肽链中的 - 片层和无规卷曲约各占50% ,几乎没有 - 螺

2、旋结构。 单一的多肽链可被蛋白酶水解为 3 组异体同形的单元,相对分子量分别为 67 KD ( 480 个氨基酸残基) 、50 KD( 405 个氨基酸残基) 及 19 KD ( 159 个氨基酸残基) ,在完整的多肽链中,3 个单元分别由单个氨基酸残基精氨酸 R、赖氨酸 K 连接5. Cp 有 6 个紧凑的结构域能够结合 6 个铜原子,位于一、六域交界面上的 3 个铜原子形成一个三核铜簇,其他3 个铜原子以单核形式分别存在于二、四、六域( 图1) . 三核铜簇不仅对于 Cp 的催化活性有着重要作用,而且有助于 Cp 结构的稳定4. 3 铜蓝蛋白的组织合成与分布 脊椎动物 Cp 主要是由肝脏合

3、成的,其他如大脑、胎盘、卵黄囊、乳腺及睾丸的支持细胞也可独立合成 Cp. 在肝细胞的内质网中首先合成前铜蓝蛋白( apo-cemloplasmin) ,进而在高尔基体中与Cu 结合形成全铜蓝蛋白( holo-cemloplasmin) ,随后 Cp 从肝脏经胆汁转运并由其他组织器官摄取6. 正常生理条件下,肝铜储备的增加可引起 Cp浓度持续性的增加,当铜储备量缺乏时会引起 Cp浓度的显着降低。 脑内合成的 Cp 主要为磷酸肌醇锚定形式( glycosylph-osphatidyIinositolanchored Cp,GPI - Cp) ,结合在星形胶质细胞膜上7. 研究发现雌激素可增加 Cp

4、 的合成,怀孕期动物雌激素浓度升高时,Cp 的浓度可增加 3 4 倍8.铜蓝蛋白主要在分布于血清当中,上述合成部位也有一定分布,在不同物种中这种分布可能会有差异。 4 铜蓝蛋白的生理功能 4. 1 铜蓝蛋白具有氧化酶功能 铜蓝蛋白本身属于多铜氧化酶家族,具有氧化酶的功能,可在其单铜离子中心接受底物电子,并将之转移到多铜离子中心,以便分子氧结合并将其还原成水9. 在此过程中,金属离子如铜和铁离子都可以作为其底物,铜蓝蛋白可以将 Fe2 +和 Cu1 +分别氧化为 Fe3 +和 Cu2 +10,从而使其在体内可以进行转运与代谢( 图 2) . 在体内,铜蓝蛋白的胺氧化酶作用可将分子氧氧化生成水或者

5、过氧化氢,对机体内的其他有机底物如苯二胺有胺氧化酶作用11,对邻苯二酚及其类似物如多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、5 - 羟色胺及色氨酸等具有邻苯二酚氧化酶的作用。 4. 2铜蓝蛋白调节铜的代谢 铜是机体必需的微量元素,Cp 在铜的代谢过程中发挥重要的作用。 铜在十二指肠被吸收后,由铜转运蛋白相关蛋白( 铜蓝蛋白、白蛋白、铜转运蛋白、某些铜复合物及组氨酸等低分子量蛋白)转运到肠上皮细胞,经过血液循环迅速进入肝、肾中。 铜的分子伴侣 ATOX1 ( ATPases-ATP7A andB) 将铜原子传递给肝肾细胞合成的 Cp13. 结合铜的 Cp 是血清中铜的主要载体,当铜蓝蛋白到达靶细胞表面时,

6、会与其相应的受体相互作用释放铜,这些铜被靶细胞吸收和利用。 通过铜蓝蛋白对铜离子的结合和释放,实现了铜在机体内的分布。 除此以外,铜对机体 Cp 的合成和代谢也有调节作用,例如,加铜螯合剂培养的 C6 神经胶质细胞阻碍了 GPI - Cp 的表达并导致细胞中 Cp 的减少,说明铜能调节 Cp 的合成。 Gitlin D 等发现 Cp的半衰期为 5. 5 d14,机体内未结合铜的 apo -Cp 其半衰期为 5 小时7,表明铜能调控 Cp 的代谢。 更进一步地研究发现,无铜结合的 Cp 是一种变构蛋白,与铜结合时会导致其沉降率及电泳动度特性发生改变,但二级结构不变; 这种变构活性不仅可以使其从肝

7、细胞内质网中释放,而且还可使其不受到胆汁所造成的酸性环境的破坏,在后续过程中,该结构仍可与铜相结合,说明脱铜铜蓝蛋白的结构也会影响铜的代谢15. 4. 3 铜蓝蛋白参与铁的代谢 Cp - 转铁蛋白系统( ceruloplasmin-ferroportinsystem,Cp - Fpn ) 是细胞内铁的主要输出途径16. 铁在体内的跨膜运输需要特定的蛋白质载体即铁转运蛋白( Ferroportin,Fpn) . 虽然有许多蛋白参与细胞铁的吸收,但目前被确认的细胞铁输出系统只有 Cp - Fpn 系统。 哺乳动物体内由小肠吸收 Fe2 +,然后以 Fe3 +的形式贮藏; 之后 Fe3 +再次被铁释

8、放蛋白还原为 Fe2 +进入血液循环; 血浆中的 Cp 利用其亚铁氧化酶活性将 Fe2 +氧化成能与 Fpn 结合的 Fe3 +,Fe3 +结合 Fpn 后被转运至靶细胞,经内吞后进行代谢或贮存。 研究表明,在星形胶质细胞中表达的以 GPI 锚定形式的 Cp 能促进铁从神经细胞中输出。 而在 Cp 基因缺失的小鼠,在网状内皮细胞和肝细胞中铁输出过程发生障碍,中枢神经系统出现铁的沉积。 另外,具有Cp 缺陷基因和患有遗传性 Cp 缺乏症的个体铜水平正常,但铁代谢严重失调17 -18. 这些都说明 Cp在铁转运过程中不可或缺的作用。 4. 4 铜蓝蛋白具有抗氧化作用 Cp 是一种重要的抗氧化剂,可

9、以抑制由亚铁离子介导产生的活性氧; 同时,Cp 还可以进一步利用抗氧化作用,减少体内金属毒性,避免组织损伤及机体功能障碍。 有研究发现,Cp 能抑制黄嘌呤氧化酶,具有类似于超氧化物歧化酶对阴离子自由基的清除功能; Cp 不仅能与血液及组织液中Cu2 +结合,具有显着抑制 Cu2 +诱发的脂质过氧化作用,而且还可有效拮抗 Cu2 +诱发的红细胞水解19. 当氧化应激毒物三硝基甲苯( TNT) 进入小鼠体内,经还原产生的 O2 -可由超氧化物歧化酶作用生成 H2O2,一般情况下 H2O2可与 Fe2 +发生Fenton 反 应 ( Fe2 + H2O2 Fe3 + OH-+OH+) ,但当 Cp

10、存在时可通过其铁氧化酶活性竞争利用上述反应环境中的 Fe2 +并将其氧化为Fe3 +,于是 Fenton 反应被消除,抗氧化作用得以实现20. 此外,Cp 在体内还可诱导一氧化氮合成酶的表达,促进机体 NO 的合成,通过 NO 清除自由基的途径而间接发挥抗氧化的作用21. 5 铜蓝蛋白与疾病 5. 1 铜蓝蛋白与遗传性铜蓝蛋白缺乏症 遗传性铜蓝蛋白缺乏症( aceruloplasminemia)是一种罕见的常染色体上 Cp 基因的突变引起的疾病23. Cp 基因的错义突变使 Cp 的亚铁氧化酶的活性丧失,致使 Fe2 +无法氧化成 Fe3 +,进而不能与铁转运蛋白( Fpn) 结合进行铁的输出

11、17. 同时,也会引起神经系统中 Fe2 +大量沉积和 Fe3 +缺乏,从而造成神经细胞因营养缺乏和自由基累积,导致组织损伤以致最终引起神经系统退行性变性17. 尽管 Cp 因错义突变会导致其铜结合能力缺失4,如 D58H,G631R,Q692K 和 G969S 等突变24; 但仍有一些突变体残存部分亚铁氧化酶活性,能与 Fpn 相结合,但比野生型 Cp 结合 Fpn 效率低( I9F,Q146E,F198S,W264S,A331D,G606E,G876A) ; 在一位年轻的杂合的重度锥体外运动失调患者身上发现了 Cp R701W 突变,该突变导致Cp 不能结合铜,但是当含铜的谷胱甘肽或含铜的

12、三磷酸腺苷酶( Ccc2p,为 ATP7B 的同源基因) 与其一起表达时,Cp R701W 可以产生 holo - Cp 并使 Fpn 分子稳定,但这种稳定状态需要一定的 Cp活性水平才能维持25,说明如果参与金属结合的ATP7B 基因不受损伤,Cp 基因的活性可以恢复。Cp R701W 也会造成大量活性氧的产生,但其具体机制仍不清楚。 治疗遗传性铜蓝蛋白缺乏症的关键是有效地进行铁清除,通过注射静脉含 Cp的血浆和去铁胺,可使肝中铁的浓度下降。 5. 2 铜蓝蛋白与 Wilson 疾病 威尔逊氏病( WD,肝豆状核变性) 归因于ATP7B( 位于 13 号染色体上) 的突变,它编码一个 ATP

13、 依赖型的铜跨膜运输蛋白,该蛋白主要负责将铜转运到两条途径中,一条途径用来与 apo- Cp 相结合形成 holo - Cp; 另一条是将肝中多余的铜随胆汁排出肝脏,因而 ATP7B 功能的缺陷不仅会影响 Cp 的合成,还导致铜在肝脏和脑等器官中积累10. 研究发现,ATP7B 基因突变热点在不同人群之间有显着差别。 在西方患者中主要是3207 位的碱基 CA 的点突变导致组氨酸被谷氨酰胺所替代,而在中国主要的基因突变位点则是第八外显子上的 2333 基因 GT 的点突变,使精氨酸被亮氨酸所取代26. 传统的 WD 病理学认为 ATP7B 突变会造成铜从细胞排出障碍,从而发生肝铜过载、肝细胞凋

14、亡以及铜溢出到脑脊髓液中,造成中枢神经系统氧化损伤27. 但也有其他的病理学理论指出,在星形胶质细胞中 ATP7B 障碍可能导致产生受损Cp 进而导致 Fe 的流出17,情况类似于遗传性 Cp缺乏症28. 威尔逊氏病必须进行药物终身治疗,严重者可以进行肝移植。 5. 3 铜蓝蛋白与其他相关疾病 Cp 的超氧阴离子自由基清除作用,使它具有一定的抗炎效应,因而被作为急性时相反应蛋白,在炎症反应、外科创伤或者感染时 Cp 的浓度将会加倍。 许多病理条件下 Cp 可以升高,如 1 型和2 型糖尿病、严重不稳定型心绞痛等心血管疾病、风湿性关节炎。 而在某些病理情况下( 如 Wilson病中) Cp 却下

15、降3. 近期研究显示,Cp 也介导房颤的炎症通路29. 阿尔茨海默病是由氧化应激效应对机体造成氧化损伤而产生的疾病,当 Cp功能障碍或其合成紊乱时,势必引起体内铜的蓄积,因此 Cp 也与阿尔茨海默病有关30. 另外,肿瘤生长需要血管生成,新血管的形成需要大量的铜,高浓度的 Cp 是铜离子的最好来源13. 因此,Cp 在恶性肿瘤的形成中有重要的作用,从癌症的临床治疗研究方面也证实 Cp 是一个有用的癌症治疗指标31.临床上,铜蓝蛋白对某些肝、胆、肾等疾病的诊断也具有一定意义。 例如,Wilson 病患者血清铜蓝蛋白含量降低,超过 50% 的肝转移瘤、肿瘤引起胆道阻塞及胆石症病人血清铜蓝蛋白增高。

16、肾病综合征时,血清铜蓝蛋白降低。 其他如一些传染病、白血病、缺铁性贫血病也可引起铜蓝蛋白增高。 现在已经有商品化的测定铜蓝蛋白含量的诊断试剂盒在使用。 6 铜蓝蛋白的演化 含铜结合位点的氧化酶家族分为单铜和多铜氧化酶家族。 单铜氧化酶包括菌蓝蛋白( Rusticya-nin) 和杯蛋白 cupredoxin ( 如根瘤素 nodulins 和dinodulins) ,它们都只含有一个铜结合位点 T1Cu( 亦称之为 blue copper binding domain,BCB do-main) ,已发现菌蓝蛋白主要介导细胞色素 C 和终端的细胞色素氧化酶之间电子传递,而杯蛋白在植物根部发育起作

17、用。 铜蓝蛋白是属于多铜氧化酶蛋白家族( MCP) 的成员,含有 BCB 位点以及结构域之间呈三角形状的铜离子连接位( interdo-main copper binding site,IDCB site) ,主要包括 1个 T2Cu 和两个 T3Cu 以及 8 个组氨酸残基4. 这个家族成员根据蓝铜结合位点结构域( BCB) 的组成和功能分为 3 大类,一类是亚硝酸还原酶( 含有 2 个结构域) ,一类是漆酶和抗坏血酸氧化酶( 含有 3 个结构域) ,一类是铜蓝蛋白( 含有 6个结构域) . 进化分析显示铜蓝蛋白的 6 个结构域主要聚为两簇,1、3、5 结构域聚为 1 簇,2、4、6结构域聚为 1 簇,提示它们的祖先可能为 2 域蛋白29. 根据单铜和多铜氧化酶结构比较分析的结果,认为多铜氧化酶家族最初始于单铜结构域的复制,形成含有两个结构域的 MCO,同时伴随BCB 位点的复制以及 T2Cu 和 T3Cu 的产生,后两者组成了 IDCB 位点。 其进化的路径如下: 单铜氧化酶最先出现,然后出现2 域蛋白,包含2 个 BCB位点和 1 个 IDCB 位点。 随后,第一结构域中的BCB 位点缺失,形成 2dMCO - B. 如果一个单独结构域插入,则形成 AAO、漆酶等三域 MCO,而2dMCO - B 经过两次复制形成铜蓝蛋白