人类短串联重复序列

1、人类短串联重复序列(STR)的研究进展 短串联重复序列(Short tandem repeat ,STR)又称微卫星DNA, STR是一种可遗传的不稳 定的并且具有高度多态性的短的核苷酸重复序列.STR多态性具有种类多,分布广，高度多态 性等特点,并按孟德尔遗传规律1在人群中世代相传.通过对STR多态性的认识，极大地推 动了人类基因组的研究.这种多态性标志已广泛用于构建人类遗传连锁图谱、基因定位、遗 传病诊断、肿瘤细胞染色体分离与重组以及亲子鉴定等法医学检查DNA遗传标记的多态性研究发展按时间顺序可分为三代4 。第1代遗传标记:限制性片段 长度多态性(restriction fragment

2、length polymorphism, RFLP)是 Wyman 和 White 于 1980 年 偶然发现的，人类14号染色体上存在DNA片段长度有变化的区域，这些区域的结构特点是 DNA由一段序列串联重复、首尾相接而成。重复次数可在几次至数百上千次之间变化DNA 重复单位长度在数bp至数十bp之间，组成串联重复的DNA是小卫星DNAO 第 2代遗传标 记:短串联重复序列是由Holly等发现的重复单位的长度只有26 bp、重复次数一般在数次 至几十次之间的串联重复DNA序列，即微卫星DNA。微卫星DNA的等位基因片段的长度一 般在400 bp以下，故又称为短串联重复序列(STR)。第3代遗

3、传标记:单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是单个碱基的置换、插入或缺失而形成的,是美国MIT提出的 新一代多态性标记系统5，近年来成为多种研究的焦点。虽然SNP的多态性位点是最多的， 能比STR提供更全面的基因信息，但是STR还是以其独特的优点保存下来,仍被广泛的研究。STR的构成STR的核心序列为27bp，呈串联重复排列.重复次数1060次左右，其 总长度常小于400 bp.常见的有一、二、三、四核苷酸重复序列，约占真核生物基因组的5 %. 人类基因组的STR单核苷酸重复以polyA ,polyT多见,双核苷酸重复以(CA) n ,( GT

4、) n , (AA) n , ( GG) n常见,(GC/ CG)少见,其原因是由于3端为G的C(即CPG)易于甲基化.三核 苷酸重复以(CXG) n类型常见，由于三核苷酸具有高度多态性,常用作DNA的标记物.每个特定位点的STR均由两部分构成:中间的核心区和外围的侧翼区.核心区含有一个以上 称为“重复”的短序列,一般该重复单位的碱基对数目不变,而串联在一起的重复单位数目是 随机改变的，如果用一种不切重复单位的限制性内切酶把DNA分子切割成限制性片段，该限 制性片段中位于核心区的外围即是侧翼区.人群中不同个体可表现为侧翼区相同而串联重 复单位的数目不同;也可为相同数目的重复单位，但侧翼区大小不

5、同，或者两者均不同.通过对 那些非STR 位点的 DNA 限制性片段长度多态性(Rest riction f ragment lengthpolymorphism ,RFL P)研究表明，每个位点的RFL P仅能检测到1个或数个等位基因. 因此可以推论,STR位点的侧翼区变异数也仅有少数几个.这样,人群中该特定STR位点的 等位基因差异，主要应来自不同数目的串联重复2, 3。STR的分布 据GeneBank等数据库资料统计，人类23对染色体上至少分布着7901个 STR位点,每对染色体的STR位点分别超过100个，其中1、2号染色体的位点均超过600个， 性染色体上的已知位点数在264个以上，

6、现有的STR位点覆盖长度达4000cM,平均间距0. 7 cM。随着人们对STR的进一步研究，其数目还会不断增加。STR的种属特异性 与多种基因座的指纹图不同，大多数STR具有人的种属特异性，至少 是具有灵长类的种属特异性。1995年有学者6 调查了 9个STR的人种属特异性，结果在被 调查的23种动物中,FES/FPS基因座没有扩增产物，而CSF1PO、TOX、TH01、HPRTB、vWA、 F13A01等基因座则在灵长类有扩增产物，但是这些扩增产物的长度均位于这些基因座的 STR的等位基因Ladder范围之外。此后对更多STR基因座的调查也得到了相似的结论。STR产生的可能机制 目前认为链

7、滑动错配是短串联重复序列突变的主要机制。在DNA 合成过程中，一条单链DNA可以发生一过性的脱位，生成一个中间性的结构后，再与另一 DNA 单链错配，形成链滑动错配，继续DNA的复制和修复。滑动错配可以造成缺失、插入或碱基 替换。在STR中，一条DNA单链可以向后折叠后再与另一条单链复性，在复性的位置形成环 状突出,DNA修复酶可以将环状突出全部或部分切除，造成缺失。另一方面，也可以在无突出 链相对突出的位置形成一个缺口，再由聚合酶填补此缺口,DNA重复的数目增加,造成插入突 变。STR长度上的差异一般是重复单位的整数。复制滑动、姐妹染色体不等交换和遗传重 组都是可导致重复单位数目发生改变的机

8、制，但目前的研究证明复制滑动时导致STR重复数 目改变是主要机制。链滑动错配还可以发生在一段单链的DNA片段，多见于回文序列或回文 样序列。如CTGCAG和GCCNNNNNGGC。回文序列自身互补形成发夹结构,也能造成缺失 或插入。不过，仅滑动链复制错配不能解释一些重复序列的特征,如为什么两性种系的三体重 复稳定性有差异？为什么CAG重复总在有意义链上等等？所以，对STR产生和拷贝数的变 异的遗传机制解释还有滚环扩增、不等交换(unequalcrossover)和碱基置换突变 等。2基于STR的应用研究单个基因座的STR的遗传信息是很有限的,复合扩增可以增加遗传多态性信息，提高工作效 率。在复

9、合扩增中，多对引物在同一反应管中进行。引物之间的互相作用，可导致非特异性的 扩增产物出现，影响STR的分型。经大量的研究证明，只要复合扩增的条件是适当的,在绝大 多数的情况下，复合扩增从双基因座扩增、三基因座扩增、四基因座扩增、七基因座扩增，直 至15个STR基因座和一个性别基因同时复合扩增，检测方法从银染方法到用荧光标记引物 在自动测序仪中自动分型,单基因座扩增与复合扩增的STR分型具有相同的结果。目前STRs- PCR技术已形成多位点检测方法，即在同一分析反应中同时扩增来自两个或更 多的位点的等位基因，扩增的重复序列由于重复次数的差异导致STR基因座的等位基因分 型不同，在电泳分离后，用放

10、射性同位素、银染或荧光检测可区别不同的基因型STRs- PCR 产物具有不连续的可分离的长度，可以用每个基因座的几个或所有等位基因的片段构建成 等位基因阶梯(allelic ladder),肉眼观察或利用仪器比对同一基因座的等位基因阶梯和扩增 样品，从而快速和准确地确定等位基因座。STR应用于制作人类基因组遗传图谱 遗传图谱(geneticmap)是指人类基因组内基因和 专一的多态性DNA标记相对位置的图谱。STR在基因组内分布广泛、多态性程度高、可自 动化检测、成为制作基因组遗传图谱的首选遗传标记。STR作为遗传标记使人类基因组的 遗传制图和连锁分析发生了革命性的变化。1996年，法国Gen

11、e-thon实验室与美国国家卫生 研究院几个中心合作，建立了以6000多个STR为主体遗传标记、分辨率达194 kb的高精密 度图谱7 。STR的出现使遗传图的精度得到进一步提高,同时也成为物理图上的标记，从而 促进了遗传图与物理图的融合。利用STR作为遗传标记，人类基因组计划中的物理图于2000 年也顺利完成8 。STR用于法医学个体识别和亲权鉴定 法医检案中,经常会遇到极少量和较大降解的生 物检材，最好的方法是用PCR扩增STR。人体血液、精液、精斑、毛发、指甲、骨和牙齿均 可作为分析STR的DNA来源9。正是因为STR广泛存在于人类基因组中,具有高度多态 性、杂合性和稳定性。当把几个ST

12、R位点联合分析后，可以得到相当高的累积个体识别率和 父权排除率。据统计，两个无亲缘关系的个体基因型完全一致的概率 10 - 12，因而STR用于 法医学领域有着广阔的前景。国内学者对粤、桂、琼地区14个人群STR基因座频率调查显 示15个STR基因座在14个人群中累积个体识别能力在1.05 X10 - 163. 18 X 10 - 18 , 累积非父排除率均在0. 9999 10 以上。泰国学者对泰国人的15个STR位电的分析得出累 积个体识别能力为7. 01X10 - 18，累积非父排除率为0. 999999545 11 。从这些数据充分显 示，STR在法医学个体识别和亲权鉴定中，为司法审判

13、、侦案、破案提供有利的科学依据12 。在由国际刑警组织注册的对性侵犯定罪的立法提案程序中，所有参与的实验室都必 须检测4个重要位点，即:THO1、VWA、FGA和D21S11,他们的个体识别能力强而有效，已 成为欧洲众所周知的核心位点,1999年后又扩展了另外的3个位点。最近在北美已经引入以 STRs为基础的DNA索引数据库，建立了 13个STRs位点的复合扩增:THO1、VWA、FGA、 TPOX、CSF1PO、D3S1358、D5S181、D3S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51 和 D21S11。STR用于遗传学多态性研究STR标记多位于非编码区，变异一

14、般不影响人体的结构与功能，突变在进化过程中受自然选择 压力较小,以近乎稳定的速率传递且不断积累，形成多样性。通过研究STR多态性，变异速率 以及比较序列间差异、人群间差异，分析不同人群间的遗传距离,就可从分子生物学角度揭示 人类的起源、迁徙、进化等历史进程13 。目前，根据mtDNA、STR标记、Y染色体DNA 以及多态性Alu I序列的研究，大多数分子遗传学家支持现代人类单起源学说认为现代人类 起源于20万年前的非洲原始部落,然后向世界各地迁徙。但也有学者支持现代人类多起源, 认为除非洲外，亚洲、欧洲也可能是人类发源地。Karafet 14 等通过Y - DNA创立者单体型 的分析揭示存在1

15、个以上的父系创立者单体型，美洲土著具有亚洲起源。STR在疾病诊断和治疗中的应用DNA多态遗传标记的建立为基因染色体定位奠定了 基础,家系连锁分析是目前最常用的基因定位方法。目前连锁分析定位基因所用的遗传标记 主要是STR。STR等位基因数目较多,可提供的信息量大,因而在进行连锁分析时所需的样品 数比采用双等位基因标记(SNP)时要少，适用于致病基因的初步定位15 。STR与遗传病的诊断 近年来，发现基因内外的一些STR与遗传病的发病有关.目前 报道较多的疾病有7种遗传病与三核苷酸重复片段扩增突变有关:脆性X综合征、脊髓延髓 肌肉萎缩、强直性肌营养不良、Huntington舞蹈征、脊髓小脑共济失

16、调I型、FRAXE轻度 智力低下和齿状核苍白球丘脑下部萎缩.在脆性X综合征中,FMR1gene中的(CGG)顺序 在正常人中的重复次数少于60次,携带者60100次，而发病者则多于100次.也有人用 STR来研究单基因病，如苯丙酮尿症等15 ,现在,STR越来越多用于研究多基因病,如采用 STR对I型糖尿病进行全基因组扫描，发现12个位点与该疾病高度相关，其中包括HLA22 抗原位点.更多的人开始用STR方法对高血压、哮喘和II型糖尿病进行了研究。STR与肿瘤的诊断 微卫星DNA由于复制错误引起简单重复序列改变，常产生微卫 星不稳定性(Microsatelliteinstability ,MS

17、I)，表现为肿瘤组织与其相应非肿瘤组织DNA结构 性等位基因的大小发生改变.它在胃肠道肿瘤的发生、发展过程中扮演重要角色，可能是肿瘤 发生的一种新机制.MSI首先在结直肠癌中观察到,1993年，有的学者在研究遗传性非息肉 大肠癌中观察到多条染色体均有短的核苷酸重复序列(CA) n的增加或丢失，提示MSI散布 于整个基因组中.后来陆续在子宫内膜癌、肺癌、乳腺癌、食管癌以及慢性髓细胞性白血病 中都出现MSI ,人们认为MSI可能在肿瘤基因调控中起重要作用，参与肿瘤的发生和发展. 这种基因水平的改变常先于表型的改变，通过MSI的检测有助于早期发现某些肿瘤及对高 危人群进行早期防治.STR用于器官移植

18、 目前,各种器官移植技术在国内外已有一定发展，利用基因诊断技 术进行术前组织配型，提高了器官移植的成功率;而对器官移植后植入状态的检测,对了解受 者治疗疗效、指导医生用药、预后估测等更是有重要意义。朱平16 等认为STR作为骨髓 移植后供者细胞植活的证据是很客观的:供者细胞植活后，受者外周血出现供者的STR类型， 而受者口腔黏膜细胞仍为原来类型。因此，可以长期观察供者细胞在受者体内存活情况。STR适合于降解、微量检材的检测STR的扩增片段大多在400 bp以下,PCR扩增容 易成功，适用于降解检材的检验。灵敏度也高于VNTR,达到ng级。实验已经证明，实验室条 件下，或模拟的各种环境条件下，各种斑痕,如血痕、精斑、阴道液斑,甚至是自然条件