蛋白质的折叠

1、中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室王志珍导读您知道蛋白质折叠吗？这是一个很新的词。新到什么程度？您可以上网到著名的不列颠百科全书网站检索一下 proteinfolding （即蛋白质折叠），还没有相应的解释。您知道“蛋白质折叠病”吗？疯牛病、老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇 症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤、白内障等等都是“折叠病” 。就是相关蛋白质的三维 空间结构异常。这种三维空间结构异常是由于致病蛋白质分子通过分子间作用感染正常蛋白 质而造成的。请注意，致病蛋白质分子与正常蛋白质分子的构成完全相同，只是空间结构不同。您知道蛋白质折叠有多复杂吗？美国“科学美国人”曾经

2、载文称，用当今最快的计算机模拟计算蛋白质折叠，要花一百年！而当今最快的计算机已经达到每秒几万亿甚至十几万亿 次浮点运算的高速了。对于生命奥秘的探索， 将贯穿新世纪乃至新千年人类的历史。而蛋白质折叠，就是其中的一大课题。请您认真阅读王志珍研究员的这篇文章。不要害怕肽键、肽链、分子伴侣这类专业名词，因为它们与您、您的健康息息相关。读完这篇文章，这些专业名词将成为您的朋友。提要研究蛋白质的折叠， 是生命科学领域的前沿课题之一。蛋白质是一种生物大分子，基本上是由20种氨基酸以肽键连接成肽链。肽链在空间卷曲折叠成为特定的三维空间结构，包 括二级结构和三级结构二个主要层次。有的蛋白质由多条肽链组成，每条肽

3、链称为亚基， 亚基之间又有特定的空间关系，称为蛋白质的四级结构。 所以蛋白质分子有非常特定的复杂的空间结构。通过“蛋白质结构预测”破译“第二遗传密码”，是蛋白质研究最后几个尚未揭示的奥秘之一。天津大学和中国科学院生物物理所的科学家已经做出了优秀的研究成果。他们预测，蛋白质的种类虽然成千上万，但它们的折叠类型却只有有限的650种左右。我国科学家在分子伴侣和折叠酶方面有特色的研究成果，也已经赢得了国际同行的注意。外界环境的变化可以导致蛋白质空间结构的破坏和生物活性的丧失，但却并不破坏它的一级结构（氨基酸序列），这称为蛋白质的变性。变性的蛋白质往往成为一条伸展的肽链， 在一定的条件下可以重新折叠成原

4、有的空间结构并恢复原有的活性。对蛋白质变性作用的认识是我国科学家吴宪在三十年代首先提出的。蛋白质异常的三维空间结构可以引发疾病，疯牛病、老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤、 白内障等等都是“折叠病”。造成疯牛病的 Prion病蛋白可以感染正常蛋白而在蛋白质之间 传染。研究蛋白质的折叠问题不仅具有重大的科学意义，而且在医学和在生物工程领域具有极大的应用价值。1分子生物学的中心法则五十年代初运用X射线衍射技术解出了生命遗传物质脱氧核糖核酸（DNA）分子的三维空间结构，阐明了生物遗传的分子基础，揭示了这个最主要的生命活动的本质，从而开创了在分子水平上认识生命现

5、象的新学科分子生物学。分子生物学的出现是经典生物学转变成近代生物学的里程碑。尽管自然界的生物物种千千万万，生命现象繁杂纷飞，在分子水平研究生命，使我们认识到各种生命现象的基本原理却是高度一致的！从最简单的单细胞生物到最高等的人类，它们最基本最重要的组成物质都是蛋白质和核酸。核酸是生物体遗传信息的携带者，所有生物体能世代相传， 就是依靠核酸分子可以精确复制的性质。蛋白质则是生命活动的主要承担者。所有的生命活动，呼吸、运动、消化 ,甚至感知、思维和学习， 无一例外是依靠蛋白质来完成的。蛋白质是一种生物大分子，基本上是由20种氨基酸以肽键连接成肽链。肽键连接成肽链称为蛋白质的一级结构。不同蛋白质其肽

6、链的长度不同，肽链中不同氨基酸的组成和排列顺序也各不相同。肽链在空间卷曲折叠成为特定的三维空间结构，包括二级结构和三级结构二个主要层次。有的蛋白质由多条肽链组成，每条肽链称为亚基，亚基之间又有特定的空间关系，称为蛋白质的四级结构。 所以蛋白质分子有非常特定的复杂的空间结构。每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的组成和排列顺序，由这种氨基酸排列顺序决定它的特定的空间结构，这就是荣获诺贝尔奖的著名的Anfinsen原理。蛋白质分子只有处于它自己特定的三维空间结构情况下，才能获得它特定的生物活性；三维空间结构稍有破坏，就很可能会导致蛋白质生物活性的降低甚至丧失。二十世纪生物学领域最重要的成就之一，是

7、继DNA双螺旋结构的发现总结出分子生物学的中心法则，揭示生命遗传信息传递的方向和途径。 近半个世纪以来对阐明中心法则有关 问题有杰出贡献而获得诺贝尔奖的学者先后多达34位。分子生物学的中心法则简单表达如下：分子生物学的中心法则中，DNA和核糖核酸（RNA）的复制、DNA转录成RNA、RNA逆转录成DNA以及以信使RNA为模板翻译成多肽链的过程和机制基本上已经阐明。但从多 肽链折叠成蛋白质的过程，即所谓“新生肽的折叠”问题，是中心法则至今留下的空白，又 是从“遗传信息”到“生物功能”的关键环节，有待我们在21世纪去解决。2蛋白质折叠与“折叠病”人们对由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基

8、的变化就引起疾病的情况 已有所了解，即所谓“分子病”，如地中海镰刀状红血球贫血症就是因为血红蛋白分子中第 六位的谷氨酸突变成了颉氨酸。现在则发现蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，只是其结构或者说构象有所改变也能引起疾病，那就是所谓“构象病”，或称“折叠病”。大家都知道的疯牛病，它是由一种称为Prion的蛋白质的感染引起的，这种蛋白质也可以感染人而引起神经系统疾病。在正常机体中，Prion是正常神经活动所需要的蛋白质，而致病Prion与正常Prion的一级结构完全相同，只是空间结构不同。这一疾病的研究涉及到 许多生物学的基本问题。一级结构完全相同的蛋白质为什么会有不同的空间结构，这与 Anfins

9、en原理是否矛盾？显然这里有蛋白质的能量和稳定性问题。从来认为蛋白结构的变化来自于序列的变化，而序列的变化来自于基因的变化，生命信息从核酸传递到蛋白。而致病 Prion的信息已被诺贝尔奖获得者普鲁辛纳证明不是来自基因 的变化，致病蛋白 Prion导致正常蛋白Prion转变为致病的折叠状态是通过蛋白分子间的作 用而感染！这种相互作用的本质和机制是什么？仅仅改变了折叠状态的分子又如何导致严重 的疾病？这些问题都不能用传统的概念给予满意的解释，因此在科学界引起激烈的争论，有关研究的强度和竞争性也随之大大增强。由于蛋白质折叠异常而造成分子聚集甚至沉淀或不能正常转运到位所引起的疾病还有 老年性痴呆症、囊

10、性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤、白内 障等等。由于分子伴侣在蛋白质折叠中至关重要的作用，分子伴侣本身的突变显然会引起蛋白质折叠异常而引起折叠病。随着蛋白质折叠研究的深入，人们会发现更多疾病的真正病因 和更针对性的治疗方法，设计更有效的药物。现在发现有些小分子可以穿越细胞作为配体与 突变蛋白结合，从而使原已失去作战能力的突变蛋白逃逸“蛋白质质量控制系统”而“带伤作战”。这种小分子被称为“药物分子伴侣”，有希望成为治疗“折叠病”的新药。新生肽的 折叠问题或蛋白质折叠问题不仅具有重大的科学意义，除了上面提到的在医学上的应用价值外，在生物工程上具有极大的应用价值。基因工程和

11、蛋白工程已经逐渐发展成为产值以数十亿美元计的大产业，进入 21世纪后，还将会有更大的发展。但是当前经常遇到的困难，是在简单的微生物细胞内引入异体DNA后所合成的多肽链往往不能正确折叠成为有生物活性的蛋白质而形成不溶解的包含体或被降解。这一 “瓶颈”问题的彻底解决有待于对新生肽链折叠更多的认识。(3蛋白质折叠和“第二遗传密码”蛋白质折叠的研究，比较狭义的定义就是研究蛋白质特定三维空间结构形成的规律、稳定性和与其生物活性的关系。在概念上有热力学的问题和动力学的问题；蛋白质在体外折叠和在细胞内折叠的问题；有理论研究和实验研究的问题。这里最根本的科学问题就是多肽链 的一级结构到底如何决定它的空间结构？

12、既然前者决定后者，一级结构和空间结构之间肯定存在某种确定的关系，这是否也像核甘酸通过“三联密码”决定氨基酸顺序那样有一套密码 呢？有人把这设想的一级结构决定空间结构的密码叫作“第二遗传密码”。如果说“三联密码”已被破译而实际上已成为明码，那么破译“第二遗传密码”正是“蛋白质结构预测”从理论上最直接地去解决蛋白质的折叠问题，这是蛋白质研究最后几个尚未揭示的奥秘之一。“蛋白质结构预测”属于理论方面的热力学问题。就是根据测得的蛋白质 的一级序列预测由 Anfinsen原理决定的特定的空间结构。蛋白质氨基酸序列，特别是编码 蛋白质的核甘酸序列的测定现在几乎已经成为常规技术，从互补DNA (cDNA)序

13、列可以根据“三联密码”推定氨基酸序列，这些在上一世纪获得重大突破的分子生物学技术，大大加 速了蛋白质一级结构的测定。目前蛋白质数据库中已经存有大约17万个蛋白的一级结构，但是测定了空间结构的蛋白大约只有1. 2万个，这中间有许多是很相似的同源蛋白，而真正不同的蛋白只有1000多个。随着人类基因组计划的胜利完成，解读了人类DNA的全序列， 蛋白质一级结构的数据增长必定会出现爆炸的态势，而空间结构测定的速度远远滞后，因此二者之间还会形成更大的距离，这就更需要进行蛋白质结构的预测。由于蛋白质分子结构本身的极端复杂性决定了结构预测不可能一蹴而就。目前结构预测的方法大致可分为两大类。一类是假设蛋白质分子

14、天然构象处于热力学最稳定，能量最低状态，考虑蛋白质分子中所有原子间的相互作用以及蛋白质分子与溶剂之间的相互作用，采用分子力学的能量极小化方法，计算出蛋白质分子的天然空间结构。第二类方法是找出数据库中已有的蛋白质的空间结构与其一级序列之间的联系总结出一定的规律，逐级从一级序列预测二级结构，再建立可能的三维模型，根据总结出的空间结构与其一级序列之间的规律，排除不合理的模型，再根据能量最低原理得到修正的结构。这也就是所谓“基于知识的预测方法”。但是，第一类方法遇到在数学上难以解决的多重极小值问题，而逐级预测又受到二级 结构预测精度的限制。 因此必须解决这些困难， 或者发展新的方法， 将基于知识的预测

15、方法 与计算化学以及统计物理学结合起来，才有希望能破译“第二遗传密码”。另一方面，和以往只能利用存入蛋白质数据库的数据进行预测相比，人类DNA的全序列的测定给予蛋白质结构预测更自然的、 信息量更大得多的数据库，因此可用基于同源性的重复循环技术非常可靠地灵敏地进行结构预测。已经有人根据基因组的数据用统计方法重新估计了蛋白质折叠类 型数目大约为1000种，这和早期的理论估计是一致的。显然，人类基因全序列的揭示必然 为蛋白质结构预测、蛋白质相互作用的预测以及单核甘酸多态性的分子表型预测开辟前所未 有的广阔天地。天津大学和中国科学院生物物理所的科学家已经活跃在蛋白质结构预测领域， 并做出了优秀的研究成

16、果。他们预测，蛋白质的种类虽然成千上万，但它们的折叠类型却只 有有限的650种左右。蛋白质折叠第二个根本的科学问题是具有完整一级结构的多肽链又是如何折叠成为它 特定的高级结构？这是一个折叠的动力学的问题，长期以来，主要用体外的实验方法研究， 虽然已有四五十年， 但至今尚未解决。我们知道，多数蛋白质在体外是不稳定的，外界环境的变化，如温度、酸度等， 都可以导致其空间结构的破坏和生物活性的丧失，但却并不破坏它的一级结构，这称为蛋白质的变性。 对蛋白质变性作用的认识是我国科学家吴宪在三十年代基于他在国内的工作首先提出来的，长期以来已经为国际上广泛接受。变性的蛋白质往往成为一条伸展的肽链，由于一级结构

17、仍然完整，根据 Anfinsen原理它应该可以在一定的条件下重新折叠成原有的空间结构并恢复原有的活性。这就是长时间来在体外研究蛋白质折叠的基本模型。现在知道，绝大多数蛋白质从一条伸展的肽链，折叠成有其特定结构的、有活性的蛋白质，并不是一步完成的，而要经过许多折叠的中间状态。含有多个亚基的蛋白质分子，亚基间的相互作用使之组装成复杂蛋白分子。研究人员用实验方法，特别是近年来发展的快速测定方法去追踪蛋白质重折叠的全过程，尽可能捕捉折叠过程中的每一个中间状态。不同阶段的折叠速度不同，有的比较慢，比较容易发现和捕捉；但有的非常快，必须要有特殊的设备配合各种测试技术去进行研究。最近有人尝试大幅度降低温度使

18、折叠速度减慢而得以追踪。 最终，人们要定量地描述整个折叠的动态过程，拍出一部蛋白质折叠的电影来，但这必然要经过一个长时间的艰苦的工作。4细胞内的蛋白质折叠尽管多年来体外蛋白质折叠研究为揭示蛋白质折叠的本质提供了大量信息，但细胞内蛋白质的生物合成，一个广义的蛋白质折叠问题，是一个比试管内蛋白质折叠复杂得多的多的过程。蛋白质的多肽链都是在细胞内的一种由多种蛋白质和核糖核酸所组成的被称为核糖体 的复合物上，以信使核糖核酸为模板，从氨基末端开始，按照三联密码，一个氨基酸一个氨基酸加上去而合成出来的。 现在比较一致的看法认为，这种新合成出来的多肽链（称为新生肽）在合成过程中长度不断增加，并在延伸的同时也

19、在进行着折叠，而不是在合成完成脱离核糖体后再自发折叠成为蛋白质。所以上面介绍的在体外用变性伸展肽链的重折叠研究蛋白 质折叠的模型看来并不是研究细胞内蛋白质折叠的理想模型。由于每个信使核糖核酸可以同时携带多个核糖体，而每个核糖体上的多肽链的延伸程度又是不同的，所以核糖体上的多肽链的合成同步化是目前研究新生肽折叠的关键问题，但一直没有解决。我们实验室暂时绕过这个障碍，制备一系列从氨基末端开始具有不同长度的肽段，比较研究它们的构象作为模型， 对新生肽在合成延伸的同时也在进行着折叠的观点已经提供了大 量信息。从核糖体上合成出来的肽链还需经过与翻译同时进行的和翻译完成后的化学加工， 如形成二硫键，完成糖

20、基化作用、羟基化作用、磷酸化作用等化学修饰。化学修饰往往与肽 链的折叠密切相关，没有化学修饰的肽链往往不能完成正确折叠。新生肽还要被运送到细胞的特定部位，“各就各位”才能发挥它特定的生物功能：例如进入细胞核中白核蛋白与 DNA组成染色体；进入线粒体的蛋白参与能量代谢；组成膜的蛋 白以及分泌到细胞外的蛋白必须进入内质网，先进行加工再继续转运等等。这些转运都有一个穿越膜结构，甚至是多次越膜的过程。有完整空间结构的蛋白分子是不能越膜的，因此在转运过程中折叠过多的分子必须解开折叠后才能越膜。此外，多亚基蛋白必须进行组装。 有些蛋白质，如一些酶和激素，以前体形式合成后还要经过水解除去某一段序列后才能成熟

21、为 有活性的分子。所有这些都包含在新生肽成熟为功能蛋白的全过程中，每一步都涉及新生肽链的构象变化、折叠和调整。在试管中做蛋白质折叠实验的条件往往人为简化或不得不简化， 与新生肽在细胞内折叠的条件有质的或量的差别。所有的细胞中都存在着大量的蛋白质、核酸、多糖等各种生物大分子， 它们大约占用细胞容积的 2030%,总浓度高达每升80-200 克，因此任何一种大分子都处于一个充满其他大分子的“拥挤”环境中，使得任何一个大分子的实际可及空间大大减少，这种情况对所有大分子之间的反应在热力学和动力学上都有很 大的影响。最近，有人呼吁，在体外研究蛋白质折叠必须考虑模拟细胞内的“拥挤”环境。 我们实验室在这方

22、面的研究已经得到国际同行的注意。此外，某一种蛋白在某一时刻在细胞内的局部浓度可以非常高，这样高浓度的蛋白质在试管中必然发生聚集而不可能完成折叠。 所以，在体外进行的实验，为了提高蛋白折叠效率，并且有利于进行分析，实验所用的蛋白浓度总是很低的；温度也常在37摄氏度以下，有时低到 10摄氏度以下，以减缓反应速度。溶液成分也尽量简单，便于分析。5分子伴侣蛋白和折叠酶最近15年来，由于发现一些蛋白质的折叠必须在另一些蛋白质存在时才能正确完成的 现象，对蛋白质折叠的概念产生了革命性的全新认识，“自发折叠”的经典概念发生了转变和更新，这是蛋白质折叠研究中的大事。现在认为新生肽在细胞内的折叠和成熟在多数情况

23、 下是不能自发完成的，而是需要别的蛋白质帮助的。这个新概念并不与Anfinsen原理相矛盾，而是在动力学的观点上完善了Anfinsen学说。一个在热力学上可以成立的反应由于动力学的能障等问题在实际上未必可以完成，但在别的蛋白质帮助下可以克服能障而得以进行。目前已认识到的在细胞内帮助新生肽链折叠的蛋白有二类：一类称为分子伴侣蛋白， 另一类是催化与折叠直接有关的化学反应的酶，又称折叠酶。分子伴侣显然是一种具有新功能的蛋白，近年来已经鉴定到越来越多新的分子伴侣蛋白或已知蛋白的新的分子伴侣活性。它们的精细三维结构、结构与功能的关系、它们帮助生物大分子折叠的机制都在活跃的研究之 中；特别是有些蛋白的分子

24、伴侣活性和在同一分子上的其他生物活性之间的关系以及在生命 活动中的协作和调控更引起人们的兴趣。现在发现，不仅蛋白质的折叠需要分子伴侣的帮助，DNA分子和RNA分子的折叠也往往需要分子伴侣的帮助，因为功能DNA和RNA分子，特别是它们与蛋白质形成的复合物都要有一定的构象。DNA和RNA分子本身具有较大的刚性，不容易折叠或在折叠过程中容易发生折叠错误，因此需要DNA分子伴侣或RNA分子伴侣帮助它们折叠而形成特定的构象。另一方面，不仅蛋白质，现在发现有一些核酸和磷脂也能发挥分子伴侣的作用；更有趣的是最近发现核糖体也有分子伴侣活性。有些生物大分子在成熟过程中需要一系列的分子伴侣在不同的阶段给予帮助才能完成最终的折叠。另外，有一些小分子物质对某些蛋白质在体外的折叠有帮助作用，被称之为“化学分子伴侣”。我国科学家在分子伴侣和折叠酶方面的有特色的研究成果已经赢得